白藜芦醇对模拟日光照射后黑素和朗格汉斯细胞的影响(2)
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1.3 实验仪器:日光模拟器(GS2006 3.0E版,中国计量科学研究院,北京),包括一个450W的氙灯加上一个WG320 滤光片(Schott,Clichy,France),光线输出模拟连续的290 nm 至400nm 的日光紫外线输出,可发射出15倍太阳光强度的模拟日光。
1.4 实验方法:①试验开始前测定每位志愿者MED;②在志愿者背部6个部位进行如下操作:部位1～4分别涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质30min后予1.5倍MED的ssUVR,部位5仅予照射而不涂抹检测物质(阳性对照),部位6既不照射亦不涂抹检测物质(阴性对照)。详见表1。各照光部位每日照射1次,连续照射4天。末次照射后24h对受试部位皮肤取材,用10%甲醛固定后行石蜡切片,进行Fontana Manna 染色及CD1a免疫组化染色。
1.5染色方法
1.5.1Fontana Manna染色:①切片常规用二甲苯脱蜡,经各浓度乙醇至水洗;②蒸馏水清洗5min×2次;③将切片置于GRAM液中10min;④用蒸馏水彻底清洗1h;⑤将切片置于FONTANA染液中,避光放置24h。蒸馏水清洗5min×2次;⑥在切片上滴加0.1%氯化金30μl,4min,蒸馏水清洗5min×2次;⑦5%硫代硫酸钠固定2min,蒸馏水清洗5min×2次;⑧ 过滤好的KERNECHTROT染液,染色5min;⑨乙醇、二甲苯脱水、透明。中性树胶封片,镜下观察。
1.5.2CD1a免疫组化染色(S-P法):①切片常规用二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水;②置于pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中,121。C蒸汽高压消毒箱内抗原热修复10min;③自然冷却后,3%H2O2去离子水孵育5～10min。PBS冲洗,2min×3次;④滴加一抗,4℃冰箱过夜。PBS冲洗,2min×3次;⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,37℃孵育30min;PBS冲洗,2min×3次;⑥显微镜下控制DAB显色,大约5～20min。蒸馏水冲洗;⑦苏木素复染;⑧乙醇、二甲苯脱水、透明,中性树胶封片。
1.6结果判断标准:①MCI:使用Image-Pro-Plus 6 ......
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