单核巨噬细胞集落刺激因子对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响(2)
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1材料和方法
1.1 材料和仪器:DMEM培养液、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco,美国);四甲基偶氮唑蓝MTT及DMSO(上海鼎国生物技术有限公司);单核巨噬细胞集落刺激因子(欣百诺生物有限公司);Ⅰ型和Ⅲ型胶原ELISA试剂盒(R&D,美国);FACSCalibur 流式细胞仪(BD,美国);细胞培养箱(Heal Force);离心机(Beckman)。
1.2 方法
1.2.1人皮肤成纤维细胞的原代分离与培养:取我院泌尿外科儿童包皮环切术后包皮(患者知情同意)进行原代分离培养及鉴定[4]。本实验选用第4代生长状态良好且处于对数生长期的人皮肤成纤维细胞细胞用于研究。
1.2.2 MTT法检测人皮肤成纤维细胞增殖活力:收集处于对数增殖期的第4代人皮肤成纤维细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,制成单细胞悬液,血细胞计数板计数后,以2×103个/ml的密度接种于96孔培养板中,每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养24h后,小心吸弃培养液,每空加入100μl无血清培养液平衡12h。然后分别加入含有GMCSF浓度为0,25,50,75,100,150ng/ml无血清的DMEM培养液,每组8个复孔,继续培养24h。每空加入MTT(5mg/ml)20μl。37℃,5%CO2继续孵育4h,终止培养,吸弃孔内培养上清液,加入DMSO150μl,振荡10min,在酶联免疫检测仪上测定出各孔的吸光度(A)值。
1.2.3 流式细胞仪检测人皮肤成纤维细胞周期:取对数生长期细胞,加入含有GMCSF浓度为75ng/ml的无血清培养液,实验设GMCSF组及空白组,培养24h后,血细胞计数版计数,制成1×106个/ml细胞悬液,1 000r/min离心10min,弃上清,加入PBS洗一次,加入4℃的70%乙醇固定,4℃冰箱保存。然后取出所固定的细胞,离心弃去乙醇,用PBS重悬细胞,离心,弃上清,用PI染液(含RNAase酶),4℃避光染色30 min。用流式细胞仪测定人皮肤成纤维细胞倍体。采用多参数细胞分析软件处理,对样本进行DNA含量及细胞周期分析。
1.2.4 夹心ELISA法检测人皮肤成纤维细胞培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌:取对数生长期人皮肤成纤维细胞,实验设GMCSF组及空白组。其中GMCSF组加入浓度为75ng/ml的无血清培养液,空白组加入相应量PBS溶液。各组细胞孵育24h后终止培养。取终止培养后的培养液,离心去沉淀,取上清。Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量测定按照试剂盒说明书操作,每组设3个复孔,在450nm波长酶标仪上测各孔吸光度值。根据标准曲线换算成Ⅰ、Ⅲ型胶原的浓度。
1.2.5统计学分析:所有计量资料均以x±s表示,采用SPSS11.0软件进行方差分析,以α=0.05作为水准,P<0.05表明差异有统计学意义。各组间采用SNK-q法检验。
2结果
2.1 人皮肤成纤维细胞体外培养的形态观察:人皮肤成纤维细胞在体外为贴壁生长型细胞,组织块接种后第5天可见细胞萌出,到第10天可见大量细胞游出(图1A)。细胞界限清楚,胞体较大,以梭形为主,也可见不规则三角形,胞质向外伸出2～3个长短不一的突起,胞核呈类圆形或椭圆形居中。待细胞互相融合后,细胞排列紧密,多呈放射状、栅栏状生长见(图1B)。
2.2 GMCSF对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖的影响:各浓度组测定的MTT值如下表所示(见表1),对其进行方差分析(见表2),结果示:F=27462,P<0.001,因此可以认为各个处理组总体均数不全相等,即不同浓度的GMCSF对人皮肤成纤维细胞具有促进增殖的作用。同时对各组间采用SNK-q法两两比较,认为:低浓度的rhEGF即可起到促增殖作用,但是对于150ng/ml浓度组与空白组比较,其作用差异无统计学意义,在25～100ng/ml之间均有较明显的促进人皮肤成纤维细胞增殖的作用(P<0.05),以50ng/nl作用最为显著(P<0.05)。
2.3 流式细胞检测结果:流式细胞仪检测人皮肤成纤维细胞DNA含量结果显示:与空白组比较,浓度为50ng/ml的GMCSF组增殖期(S-G2-M)成纤维细胞所占百分数明显升高,细胞分化良好,无异常分化现象,提示经GMCSF处理24h后的成纤维细胞大多处于合成前期和合成期,具有较强的生长潜力。各组的增殖期百分数分别为,空白组:G0-G1期60.36%,S期27.57%,G2-M期12.07%;GMCSF组:G0-G1期40.28%,S期36.54%,G2-M期23.18%。
2.4 GMCSF对体外培养人皮肤成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型分泌的影响:人皮肤成纤维细胞在处理24h后,收集细胞,通过ELISA检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌情况,结果示(见表3):与空白组比较,GMCSF组上清液Ⅰ型和Ⅲ型胶原分泌水平明显增高(P<0.01),Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比值明显降低(P<0.01)。
3讨论
创面愈合是一个复杂而有序的病理过程,是多种修复细胞(如表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等)、细胞生长因子(如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、GMCSF等)及细胞外基质等因素相互作用的结果。既往研究认为,生长因子因具有多效性、高效性、网络性等特点在创面愈合过程中发挥着重要的作用。近年来研究发现[2],GMCSF参与调控皮肤软组织创伤愈合过程中的多个环节而备受关注。
单核巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)是一种分子量约为22KD的多功能生长因子,具有前炎症介质的作用。在创面愈合中,GMCSF对炎症细胞和组织修复细胞间相互作用进行调控,其生物学作用主要表现为诱导中性粒细胞和巨噬细胞成熟和迁移、刺激和编码其他炎症因子(MIP-1, MCP-1)及细胞生长因子(表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子等)的基因表达和蛋白质合成通过这些因子作用于修复细胞,从而达到促进创面愈合的效应。
在创面愈合过程中,创面上的GMCSF主要来源于成纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞以及炎症细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞),通过自分泌又作用于这些细胞[5-6]。本研究组在既往的研究中发现,GMCSF基因敲除的小鼠创面愈合率明显下降[7]。在糖尿病小鼠创伤模型中发现[3,8]:创伤早期,糖尿病小鼠创面表达GMCSF的量较正常小鼠下降了50%。外用GMCSF可通过增加创面促炎性因子(白介素-6)及趋化蛋白(MCP-1)的表达,增加炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)的浸润,促进创面修复细胞(如上皮细胞、血管内皮细胞等)的增殖,从而有利于糖尿病创面的愈合 ......
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