熊果苷对A375细胞与HACAT共培养模型中黑素合成的影响(2)
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1.2.2分组及给药:实验分给药组、阴性对照组和空白组。给药组熊果苷的浓度分别0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml;阴性对照组直接加培养基;空白组不加细胞,只加培养基。以空白孔调零,各组设6个复孔。
1.2.2细胞增殖活性测定:将混合后的细胞用含10%FBS和1%双抗的MEM培养基调整细胞浓度为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板,5%CO2,37℃培养箱培养8～12h。细胞贴壁后换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。培养结束前4h加5mg/ml的MTT 20μl,继续培养4h后,倒扣法去除培养液,每孔加入150μl DMSO,将培养板置于微孔板震荡器震荡10min,使结晶溶解。酶标仪490nm测定吸光度值。细胞增殖活性用A490值表示。
1.2.3 酪氨酸酶活性测定:将混合后细胞浓度调整为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板培养24h后弃培养基,换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。用pH7.4的0.01M的PBS洗涤2次,每孔加1%Triton-X溶液100μl,迅速置-80℃冰箱内放置30min后,之后室温下融化,充分裂解细胞。37℃预热,加入0.5%L-DOPA溶液50μl/孔,于37℃下反应3h,以490nm波长测定各孔OD值,每个浓度设6个复孔,每一处理因素重复3次。酪氨酸酶活性用A490值表示。
1.2.4 黑素含量的测定:采用Hunt[7]法测定黑素量。共培养细胞以4.5×104/ml,接种6孔板,每孔2ml(约90 000个细胞),置于培养箱中培养24h后,给药组用含不同浓度熊果苷的新鲜培养液换液1次,对照组只加培养基;继续培养48h后,吸弃培养液,加入0.25%胰酶0.5ml/孔消化后,加入1mlMEM中止消化,制成细胞悬液,将细胞悬液收集到10ml离心管中,1 500r/min离心5min,弃去上清液,然后加入100μl浓度为1mol/L NaOH,37℃水浴lh,充分裂解细胞和溶解黑素颗粒。加入400μl双蒸水释稀,充分混匀后,100μl/孔分别加至96孔板,置酶标仪测OD值,波长为490nm。每一处理因素重复3次。黑素含量用A490值表示。
1.3 统计分析:所测数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计,各处理组与对照组多重比较用方差分析。
2结果
2.1 黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养:Hacat细胞与A375细胞可共同存活,A375细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。Hacat细胞呈近似菱形,簇集成团。如图1。
2.2 熊果苷对共培养细胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响:见表1。
由表1可见,熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞的增殖有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞增值无明显影响。熊果苷对共培养模型中酪氨酸酶活性呈剂量依赖性抑制。熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞中酪氨酸酶活性有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞中酪氨酸酶活性无明显影响。熊果苷对共培养模型中黑素合成呈剂量依赖性抑制。熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞中黑素合成有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01);熊果苷浓度≤0.1mg/ml时,对共培养细胞黑素合成无明显影响。
3讨论
脱色药熊果苷对单独培养的人黑素瘤细胞株(A375)黑素合成的抑制作用已得到证明[8],而本实验用A375细胞与人永生化角质形成细胞(HACAT)混合培养模型,将公认的脱色药熊果苷以不同浓度作用于此模型发现:A375与HACAT在混合培养时可共同存活;脱色药熊果苷作用于此模型可剂量依赖性抑制抑制酪氨酸酶活性和黑素合成。本研究结果与解士海[9]利用正常人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养模型研究熊果苷美白机理所得结果相似。李杰等[10]利用该模型研究了中药方“白消一号”治疗白癜风的机理发现白消一号能促进黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成。结合上述两位研究者的结果说明本模型能反映脱色药物对黑素代谢的影响,可用于脱色素药物的筛选及其作用机理的研究。本模型中所用细胞能无限传代细胞,较原代培养的正常人角质形成细胞和黑素细胞容易获得和培养。本实验结果显示熊果苷抑制黑素合成的浓度与其抑制黑素细胞的增殖的浓度基本一致,说明其美白作用主要与其细胞毒性有关,与宋琦如[11]的研究结果相同。但0.5mg/ml及0.2mg/ml熊果苷对共培养细胞增殖的抑制程度低于对黑素合成抑制程度(与相应对照组比分别为P<0.05,P<0.01),0.5mg/ml熊果苷对共培养细胞增殖的抑制程度小于其对酪氨酸酶的抑制程度(与相应对照组比分别为P<0.05,P<0.01),说明脱色药熊果苷的美白机理还与其抑制酪氨酸酶活性和(或)影响黑素合成的其它环节有关。
[参考文献]
[1]Yoon TJ,Hearing VJ.Coculture of mouse epidermal cells for studies of pigmentation[J].Pigment Cell Res,2003(16):159-163.
[2]Eisinger M,Marko O.Selectine poliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79(8):2018-2022.
[3]Halaban RLangdon R,Brichall N,et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes[J].Cell Biol,1988,107:1611-1619.
[4]Lei TC,Virador VM,Vieira WD,et al.A melanocyte-keratinocyte coculture model to assess regulators of pigmentation in vitro[J] ......
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