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编号:12093734
异种肌腱基质材料生物相容性的体外评价实验(2)
http://www.100md.com 2011年5月1日 陈元良 姜平 夏学颖 陈伟 张伟
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    参见附件(2873KB,4页)。

     1.4 致敏试验:健康初成年的白化豚鼠30只, 雌雄不限,体重 300~500g。采用最大剂量法。先用材料浸出液 0.1 ml 进行注射诱导, 注射区用上述实验液贴附,然后进行激发。阳性对照采用5% 甲醛溶液, 用生理盐水作为阴性对照。

    1.5 皮内刺激实验:取新西兰白兔3只,每只动物脊柱左侧5个点注射生理盐水各0.2 ml作为空白对照,每点间隔0.2cm,右侧5个点注射材料浸提液各0.2ml,注射后24、48和72 h观察记录各注射部位状况。按皮肤反应评分系统对每个注射部位的红斑和水肿组织反应进行评分,计算局部原发刺激指数(primarily stimulation index,PII)。

    1.6 体外急性细胞毒性试验

    1.6.1培养基浸提液制备:浸提介质为含10% 小牛血清的DMEM 细胞培养液,然后按样品质量与浸提液体积比为 0.2g/cm2,在37℃无菌条件下浸提72h作为材料浸提液。

    1.6.2 细胞培养及分组:采用96孔培养板,各组均加入 5×103/ml L929 小鼠成纤维细胞悬液 200μl,37℃、5% CO2 培养箱孵育,待细胞贴壁后,分别按照以下分组定期更换培养液(100μl/次) :①阴性对照组( n=8),正常培养液;②实验组 (n=8),10% FBS+DMEM 与材料浸提原液各 50% ;③阳性对照组(n=8),含0.64%苯酚的10% FBS+DMEM;每组材料8个平行样,置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h。

    1.6.3MTT 法检测细胞活性:分别于培养 24h、48h 和 72h 取 出 1 个 96 孔 板,按照 20μl/孔、加入 5 mg/ml MTT,37 ℃、5%CO2下培养 4 h; 吸出培养液, 再加入DMSO( 150 μl/孔),室温下振荡至结晶物溶解,在酶标检测仪上( BIO-RAD Mode 680,波长为 570nm) 测定吸光度( OD 值),计算细胞增殖率(RGR)=(实验组 OD 值/阴性对照 OD 值)×100%。细胞毒性判断标准[1]:0 级为≥100%,1 级为75%~99%,2级为50%~74%,3 级为25%~49%,4级为1%~24%,5 级为0。

    1.7 遗传毒性试验

    1.7.1 Ames试验:所用菌株为组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102, 采用标准平板渗入法, 在加和不加代谢活化系统(S9) 条件下进行材料浸出液按3 cm2/ml 双面表面积之和的比例用生理盐水配置。70℃条件下, 持续24 h, 过滤后备用。样品的5 种浓度各作 3 个平行样,计数各皿菌落数。生理盐水注射液为阴性对照。阳性对照采用9-氨基吖啶、叠氮钠、2, 7-二氨基芴、2-二氯基芴。

    1.7.2 染色体畸变试验:细胞株为中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)。以DMSO作为阴性对照。阳性对照采用丝裂霉素-C、秋水仙素、环磷酰胺。

    1.7.3微核试验:昆明种小鼠50 只, 6~8 周龄, 体重25~30g, 雌雄不限。用实验材料的浸取液(分低、中、高3 个剂量组) , 喂食实验小鼠,阳性对照组每天经口给予环磷酸胺 40mg/kg。取股骨,挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀, 常规涂片, 涂片自然干燥后放入甲醇中固定10 min, 将固定好的涂片放入Giemsa 染液染色10~15min。用pH 6~8 磷酸缓冲液反复冲洗,再用蒸馏水冲洗后晾干,油镜下观察。每组观察1 000 个嗜多染红细胞, 观察嗜多染红细胞的微核, 记录微核细胞数。

    1.8 统计学分析:采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析,数据以均数±标准差表示,试验组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD 法,P<0.05 为有统计学意义。

    2结果

    2.1 急性全身毒性试验:各组小鼠观察期内进食正常,活动自如,无呼吸抑制、急促等不良反应,无惊厥、瘫痪及死亡。处死动物后解剖观察腹腔无腹水粘连,肝脾肾大体观察和组织学观察未见异常。

    2.2 致敏试验:豚鼠经激发24h后去除贴附物,于24、48 和72 h分别观察激发部位皮肤的红斑和水肿情况, 结果显示材料组和阴性对照组的皮肤反应指数均为0,无红肿、水肿、致敏性。

    2.3 皮内刺激实验:注射后各时间点观察显示,注射材料浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死,按皮肤反应评分系统,PII为0.01~0.02,为极轻微刺激。

    2.4 细胞毒性实验:在细胞培养 24h、48h、72h 的不同时相用倒置显微镜观察,除阳性对照组细胞数量减少,细胞固缩甚至崩解外,实验组与阴性对照组相似,细胞数量明显增加,生长良好(见图1)。

    所测 OD 值如表1 所示,据此计算细胞增殖率。实验材料组细胞增殖率在24h、48h、72h均大于89%,根据规定,异种材料其细胞毒性分级在0-1级,无细胞毒性,可以用作生物材料。

    2.5 遗传毒性试验

    2.5.1 Ames试验:被测试样品每剂量组对TA 97、TA 98、TA 100 及TA 102的回变菌落数, 在加与不加大鼠肝微粒体酶的条件下, 均与自发回变数相近, 阳性对照组出现明显的阳性结果。在该实验条件下, 供试品对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌均无致突变性。

    2.5.2 染色体畸变试验:供试品的各剂量组,无论加或不加大鼠肝微粒体,染色体畸变与溶剂(DMSO)对照相比, 无差异(P>0.05),且各剂量组畸变率均<5%, 在该实验条件下, 供试品对 CHL的染色体无诱变作用。

    2.5.3 微核试验:实验组微核出现率为2.4%,阴性对照组为2.1%,阳性对照9.2%。实验组与阴性对照组微核细胞率无差异(P>0.05),阳性对照组与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05)。即材料浸取液未诱发小鼠骨髓红细胞微核的增加。

    3讨论

    局部植入充填材料是整形外科修复畸形缺损的有效手段之一。长期以来,研究开发安全有效、生物相容性好、来源丰富的充填材料,一直是整形外科的研究热点。异种材料因其组成及结构与人体组织相似,与细胞亲和性强,能为细胞生长、增殖、分化及功能发挥提供近似体内组织发生发育的细胞外基质支架条件,加之其来源丰富,故逐渐成为材料研究的热点。

    异种材料在植入机体前需做预处理,以解决生物来源材料的病菌传播问题 ......

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