当前位置: 首页 > 期刊 > 《中国美容医学》 > 2011年第7期 > 正文
编号:12121156
咖啡因增强UVB辐射诱导的HaCaT细胞凋亡的研究(2)
http://www.100md.com 2011年7月1日 雷霞 刘渤 何玉英 伍津津 成琼辉
第1页

    参见附件(1984KB,3页)。

     1.2.2细胞凋亡检测:在UVB辐射后14h,收集细胞至离心管,(1~5)×106个细胞/样本,按比例混合缓冲液、Annexin V及PI,洗涤好的细胞中加入500μl染液/样本,混匀,避光孵育10~15min,上机检测。

    1.2.3 Western blot检测:在UVB辐射后1.5h收集细胞,每时间点3管,每管约1×106个细胞,加入RIPA细胞裂解液,超声破碎细胞5s,共4次,4℃、20 000×μg 离心30 min,上清即为总的细胞溶解成分,考马斯亮蓝法行蛋白定量。调整各管样品浓度为3.5μg/μl。上样,电泳,电转。封闭3h,加一抗(小鼠抗p21,BCL-2、β-actin 抗体);室温下孵育2h,加二抗(抗小鼠IgG-HRP);室温下孵育1h ,采用化学发光试剂检测法检测,曝光,显影,定影,记录实验结果。Western blot 法测得所有数据均采用UVP BioImaging Systems 采集,将X 线片扫描后的图像数据输入LabWork 3.0 软件进行图像分析,将内参β-actin 作为标准积分吸光度(standard integral absorbance,SIA),各目的条带相对积分吸光度值(relativeintegral absorbance,RIA)=样本积分吸光度值(integral absorbance,IA)/ SIA。

    1.2.4 统计学方法:采用SPSS11.0 统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK,P<0.05 为有统计学意义。

    2结果

    2.1细胞培养:倒置显微镜观察,对照组HaCaT细胞形态一致,边界清楚,排列紧密。在UVB辐射组,细胞部分变圆或不规则,细胞体积变小,培养基中有漂浮的死细胞。

    2.2细胞凋亡:各实验组在UVB辐射前1h,加入0、1、5mM 咖啡因,UVB辐射后培养14h,用Annexin V/PI方法检测细胞凋亡,结果显示,在无UVB辐射时,各浓度的咖啡因有轻度促进HaCaT 细胞凋亡的作用(A组凋亡率5.43%,B组凋亡率6.88%,C组凋亡率7.02%),但在UVB 20mJ/cm2辐射各组, 1mM和5mM 咖啡因均有促进HaCaT 细胞凋亡的作用,细胞凋亡率从20.67%(D组)分别上升至22.25%(E组)和36.61%(F组),与对照组相比,有显著统计学差异(P<0.01)(图1)。

    2.3 Western blot 检测:在无UVB辐射时,咖啡因处理组p21 和BCL-2的表达有轻度下降(p21:A组RIA值1.42,B组RIA 1.35,C组RIA 1.28;BCL-2:A组 RIA值0.98;B组RIA值0.85;C组0.78),但在UVB 20mJ/cm2辐射各组,p21和BCL-2的表达明显下降,且5mM咖啡因比1mM咖啡因作用更强(p21:D组RIA值0.97, E组RIA 0.82,F组RIA 0.56;BCL-2:D组 RIA值0.4;B组RIA值0.15;C组0.04)。与无咖啡因的UVB 20mJ/cm2辐射组,差异均有统计学意义(P<0.01)(图2)。

    3讨论

    3.1 UVB波长为280~320nm,UVB 作为明确的环境致癌因素与皮肤角质形成细胞关系密切,一般认为,高剂量的UVB辐射可引起角质形成细胞发生凋亡,而细胞凋亡在此过程中被认为是一种保护性机制,可以清除不可逆损伤细胞和潜在的癌细胞[3]。P21与细胞凋亡关系密切,在不同的情况下,可以发挥抑制凋亡或促进凋亡的作用。既往的体外细胞实验表明,UVB辐射可以使HaCaT细胞中p21蛋白发生降解,表达减少,细胞凋亡增加,而将p21蛋白转染至HaCaT细胞,细胞凋亡增加不明显,说明在UVB辐射过程中,p21发挥着抗凋亡作用[5]。而BCL-2是一种明确的凋亡抑制蛋白,在细胞凋亡中起着重要作用[6],本实验发现,20mJ/cm2UVB辐射能明显减少p21和BCL- 2的表达,诱导细胞凋亡。

    3.2 研究表明,多种食物成分和中药成分均有抵抗紫外线对皮肤的损伤作用,如大豆异黄酮,茶多酚,番茄红素,川芎,姜黄素,黄芩等[7]。咖啡因是日常咖啡、茶等饮料中的活性成分。在北美,一个成年人平均每天摄入咖啡因约200~250mg,我国咖啡因的消耗量也在逐年增加[8]。深入研究咖啡因的生物学作用不仅有治疗学意义,还能为生活保健提供指导。咖啡因生物学作用广泛,是中枢神经系统的兴奋药,对心血管系统和骨骼肌系统具有正性作用,还能促进胃酸分泌和治疗偏头痛等疾病。 有在体实验研究表明[9],口服咖啡因的SKH-1裸鼠 在照射UVB后发生皮肤癌的几率比对照组降低,而在UVB辐射前或辐射后在局部皮肤上涂抹咖啡因具有光保护作用,具体机制并未完全阐明。本实验发现,无UVB辐射时,1mM和5mM咖啡因均能轻度抑制p21和BCL-2蛋白表达,有轻度促进HaCaT 细胞凋亡的作用,而在UVB 20mJ/cm2辐射各组, 咖啡因能使p21和BCL-2的表达明显下降,并能进一步诱导细胞凋亡,且5mM咖啡因比1mM咖啡因作用更强。

    3.3 总之,本实验研究了咖啡因对UVB辐射导致HaCaT细胞凋亡的影响作用。结果表明,20mJ/cm2UVB能诱导HaCaT细胞凋亡增加,而咖啡因能进一步促进HaCaT细胞凋亡,UVB 抑制细胞p21和BCL-2蛋白表达,咖啡因能进一步抑制21和BCL-2蛋白表达,这说明其促进细胞凋亡作用与p21和BCL-2通路相关,但中间的具体机制还有待进一步的研究阐明。

    [参考文献]

    [1]Glade MJ.Caffeine- not just a stimulant[J].Nutrition,2010,26(10): 932-938.

    [2]林顺生,程波. 紫外线诱导皮肤肿瘤的信号转导通路研究进展[J].中国美容医学,2009,18(11):1692-1694.

    [3]Banerjee G,Gupta N,Kapoor A,et al ......

您现在查看是摘要介绍页,详见PDF附件(1984KB,3页)