多巴染色与光密度法在细胞水平评价原料美白功效的应用研究(2)
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1.7 原料对B16细胞黑素生成的抑制率测定方法：在6孔培养板中接种小鼠黑素瘤细胞B16，接种密度为25 000个/孔，24h待细胞贴壁后，每孔分别加入含不同浓度所测原料的培养液，以不加所测原料的培养液作为对照，平行3个复孔，将细胞在37℃，5%CO2的培养箱中培养。72h后，倾去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，采用L-多巴染色。然后，用显微镜100倍拍照，采用Image-Pro Plus6.0软件对照片进行分析，计算平均光密度值和黑素生成抑制率。
1.8 统计学处理:数据采用Origin8.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，两组间数据比较采用t检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1多巴染色特异性结果：多巴对小鼠黑素瘤细胞B16和人永生化表皮细胞HaCat染色特异性结果如图1所示。染色后平均光密度值分别为0.35±0.02,0.02±0.01。
由图可见，多巴能对小鼠黑素瘤细胞B16内的黑素进行特异性染色，而细胞的其他组分对染色不会产生干扰作用，表明多巴染色法可用于细胞内黑素的特异性染色，而且平均光密度值与黑素含量正相关。
2.2多巴染色法对细胞内黑素含量检测重现性结果：以浓度为25μg/ml的曲酸作为样品，考察多巴染色法在评价原料对细胞内黑素含量生成抑制作用的重现性，结果如图2、图3和表1所示。
由图2、图3和表1可知，浓度为25μg/ml的曲酸能够明显抑制黑素瘤细胞内黑素的生成，抑制率为(48.44±3.44)%，且板间标准偏差值仅为7.09%，板内标准偏差值小于7.22%，这充分表明采用多巴染色法对黑素细胞进行染色后，运用Image-Pro Plus6.0软件工具对黑素平均光密度进行表征，进而计算化妆品原料对细胞内黑素生成的抑制率，具有较好的板间和板内重现性，可以用于在细胞水平评价化妆品原料的美白功效。
2.3 各原料对黑素细胞内黑素生成的抑制率：采用多巴染色法分别考察了曲酸、白藜芦醇、桑白皮提取物、绿茶提取物对细胞内黑素生成的抑制作用，曲酸结果见图4、图5，白藜芦醇结果见图6，桑白皮提取物结果见图7，绿茶提取物结果见图8。
由图可见，当曲酸浓度大于6.25μg/ml时，其对黑素生成抑制率为(45.18±4.68)%；当白藜芦醇浓度大于0.63μg/ml时，其对黑素生成抑制率保持在(38.29±6.44)%左右；当绿茶提取物浓度大于25μg/ml时，其对黑素生成抑制率保持在(24.18±5.55)%左右。结果表明，曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物均对细胞内黑素的生成具有较为明显的抑制作用，而桑白皮提取物对细胞内黑素生成几乎没有抑制作用。
3讨论
细胞法已成为评价化妆品原料美白功效的主要方法之一，通过检测细胞内黑素含量的变化，达到评测一种原料是否具有美白或黑素沉积的功效。培养细胞一般使用人体皮肤黑素细胞、黑素瘤细胞及小鼠黑素瘤细胞B16等，在以筛选和评价为目的使用时，又以易于培养的小鼠黑素瘤细胞B16最为合适[5]。常用的细胞内黑素检测方法是用NaOH直接溶解经过超声裂解后的细胞内黑素，而后通过光度法来检测，但是这种方法干扰因素众多、精度低、误差很大。为了克服上述缺陷，本文采用多巴染色和光密度相结合的方法来表征细胞内黑素的含量。通过与人永生化表皮细胞HaCat的对比，确认了多巴对于黑素瘤细胞中的黑素具有染色特异性。在黑素合成过程中，酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下氧化为多巴，多巴经酪氨酸酶作用转化为多巴醌，在通过一系列后续反应最终生成黑素[6]。
在活体皮肤组织内，只有位于表皮基底细胞之间的黑素细胞富含较为丰富的酪氨酸酶，是唯一的多巴阳性细胞，因此采用多巴对黑素细胞染色具有细胞特异性[7]。同时由于多巴染色后颜色的深浅与黑素细胞内酪氨酸酶的活性正相关，也间接与黑素含量正相关，因此可以用多巴染色后黑素细胞的颜色深浅变化来表示细胞内黑素含量的变化。黑素细胞的颜色深浅变化可以采用图像法进行分析，这也是分析免疫组化照片的常用技术，具体到黑素细胞颜色分析，可以采用平均光密度法进行表征，即染色后黑素细胞的累积光密度除以所测细胞面积得到平均光密度值，实验结果表明，采用该指标表征黑素细胞颜色深浅变化具有良好的板间和板内重现性，这进一步说明采用多巴染色法在细胞水平上用于评测化妆品原料对黑素生成的抑制作用进而评测其美白功效具有良好的可行性，这为接来下采用该法评价中草药美白功效提供了方法上的基础。
通过细胞法评测，结果表明曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物均对细胞内黑素的生成具有较为明显的抑制作用，而桑白皮提取物对细胞内黑素生成几乎没有抑制作用。在体外实验中，以L-多巴为底物，测得曲酸、白藜芦醇、绿茶提取物和桑白皮提取物对酪氨酸酶活性的半数抑制浓度(IC50值)分别为4.88μg/ml、30.61μg/ml、75.48μg/ml和356.06μg/ml(数据未发表)。通过曲酸、白藜芦醇和绿茶提取物可以发现体外和细胞实验结果具有较好的相关性。值得注意的是，尽管桑白皮提取物虽然对酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用，但是在细胞实验中对黑素的生成几乎没有抑制作用，这可能与其透细胞膜能力或者与细胞表面受体结合能力有关。
综上，采用多巴染色和平均光密度的方法检测黑素瘤细胞中黑素含量，精度较高、板间板内误差较小、同时具有染色特异性，能够成功用于化妆品原料的美白功效的评测。
[参考文献]
[1]傅国强,马鹏程. 196味中药乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用[J].中华皮肤科杂志,2003,36(2):103-106.
[2]涂彩霞,张荣鑫,于志红,等.18味中药乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响[J].中华皮肤科杂志, 2006,39(7):400-402.
[3]Choi SY,Kim S,Hwang JS,et al.Benzylamide derivative compound attenuates the ultraviolet B-induced hyperpigmentation in the brownish guinea pig skin[J].Biochem Pharmacol,2004,67:707-715 ......
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