银荆感冒颗粒抗甲型流感病毒的药效学研究(1)
 |
 |
摘要：目的：研究银荆感冒颗粒对甲型流感病毒的抑制作用。方法：体外接种甲型流感病毒鼠肺适应株于狗肾细胞(MDCK)，观察银荆感冒颗粒体外抗病毒作用；体内实验(1)：以甲型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠，观察14天，计算小鼠存活率及存活天数；体内实验(2)：以甲型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠。观察肺指数，病理改变等。结果：银荆感冒颗粒体外抗甲型流感毒ECso为3.24mg/mL。银荆感冒颗粒10g/kg和20g/kg剂量组可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，降低死亡率；银荆感冒颗粒10g/kg和20g/kg剂量组可明显抑制肺指数值，抑制率分别为31.4%和29.1%。结论：银荆感冒颗粒对甲型流感病毒有一定的抑制作用。
关键词：银荆感冒颗粒；甲型流感病毒；体内外；抑制
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)11-2304-03
流行性感冒是上呼吸道传染性极强的病毒感染性疾病，在呼吸系统中发病率占首位，可引起许多并发症，重者可引起死亡。笔者运用现代工艺，选用古方银翘散结合临床化裁而制成银荆感冒颗粒，作为本院院内制剂，在临床上取得了良好疗效。为了探索该颗粒剂治疗流行性感冒的机制，笔者选择与呼吸道有关的甲型流感病毒，以该病毒感染小鼠为药物评价模型，通过感染小鼠存活率、存活天数、肺指数值与肺病理变化为指标来评价药效，同时结合体外实验，来观察银荆感冒颗粒对甲型流感病毒引起的细胞病变的作用。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 实验用药及试剂
银荆感冒颗粒，江苏省中医院药剂科提供，批号：050424；利巴韦林注射液，华北制药集团有限公司，批号：050128；RPMIMedium 1640，GIBCO公司；胰蛋白酶，上海伯奥生物技术有限公司，批号：020602；HFPES，江苏科威技术服务有限公司，批号：H3375；磷酸氢二钠，南京化学试剂厂，批号051207；磷酸二氢钾，广西西陇化工厂，批号：04119；碳酸氢钠，上海虹光化工厂，批号：050622；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：050827；青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：8040613；链霉素，大连美罗大药厂，批号：040707；乙醚，南京试剂厂，批号：050628。
1.2 实验用仪器
C02培养箱(BB16)，Beracus公司，倒置显微镜(XSZ-D2)，重庆光学仪器厂；微孔滤器，上海医药工业研究院；细胞培养板，丹麦NUNC公司；净化工作台(SW-cJ-IF)苏州安泰空气技术有限公司；FA1004型电子分析天平，上海精科天平厂。
, http://www.100md.com
1.3 实验用病毒株及细胞株
甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1)，购自中国预防医学科学院病毒所，病毒由江苏省中医院临床研究所药理实验室传代后-70℃低温冰箱保存备用；狗肾细胞(MDCK)，购自上海细胞所。
1.4 实验用动物
ICR小鼠，雌雄各半，体重13～16g，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号：SCZK(苏)2001—0008。
2 方法
2.1 银荆感冒颗粒体外对甲型流感病毒的作用
2.1.1 MDCK细胞培养新购置的MDCK细胞，用0.25%的胰酶消化，然后加入含血清培养液适量，轻轻吹打均匀，按1:3比例进行分瓶传代。实验前则接细胞于96孔培养板中，培养24h后，用于实验。
, http://www.100md.com
2.1.2 病毒毒力测定将冻存的病毒液快速冻融后，按10稀释法稀释成10-1～10-9的不同稀释液，接种到MDCK细胞培养板中，每个浓度4个孔，每孔接种150μL病毒液，于5%CO237℃静置培养，同时设正常细胞对照，4个复孔，观察细胞病变情况，以CPE不再进展时，按Reed-Muench氏法计算病毒滴度，即该病毒的TCID50。CPE程度：-，无细胞病变；25%细胞病变；++，50%细胞病变；+++，75%细胞病变：++++，100%细胞病变。
2.1.3 银荆感冒颗粒最大无毒浓度实验银荆感冒颗粒(浸膏)，每毫升相当于4.9g药材，首先将原浸膏稀释成1g/mL，再用完全培养液稀释成100mg/mL，最后用完全培养液将其分别稀释成80、40、20、10、5、2.5mg/mL的不同浓度加入长成单层MDCK细胞的96孔培养板中，每个浓度4个复孔，每孔150μL同时设立正常细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，以不出现细胞变暗、变圆、融合、脱落等病变的最大药物浓度为该药物的无毒性浓度。
, 百拇医药
2.1.4 银荆感冒颗粒TC50测定根据最大无毒浓度实验结果，将银荆感冒颗粒稀释成不同浓度，加入长成单层MD-CK细胞的96孔板，每个浓度4个复孔，1501μL/孔，同时设立正常的细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，采用孙氏综合法计算该药物对细胞的TC50。CPE程度：-，无细胞病变；+，25%细胞病变；++，50%细胞病变；+++，75%细胞病变；++++，100%细胞病变。
2.1.5 银荆感冒颗粒对甲型流感病毒的作用 已长成单层的细胞接种剂量为100TCID50的病毒，置37℃、5%C02温箱孵育2h，弃去含病毒维持液，更换含不同浓度药物的维持液，置培养箱内培养。每天观察细胞形态，连续观察3天，记录CPE程度，同时设立正常细胞对照组、病毒对照组各4孔，采用孙氏综合法计算药物半数有效浓度(ECso)和治疗指数(11)。治疗指数(-11)=TCso/ECso。CPE程度：一，无细胞病变；+，25%细胞病变；++，50%细胞病变：+++。75%细胞病变；++++，100%细胞病变。
, 百拇医药
2.2 银荆感冒颗粒体内对甲型流感病毒的作用
2.2.1 病毒感染小鼠半数致死量(LD50)测定
2.2.2银荆感冒颗粒对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用取ICR小鼠120只，体重13g～16g，雌雄各半，随机分6组，每组20只：(1)空白对照组，等量生理盐水；(2)模型组，等量生理盐水；(3)利巴韦林组，75mg/kg；(4)银荆感冒颗粒I组，5g/kg；(5)银荆感冒颗粒Ⅱ组，10g/kg；(6)银荆感冒颗粒Ⅲ组，20g/kg。以上各组均灌胃给药，给药容量10ml/kg，每天1次，连续5天。于给药第2d各小鼠(除空白对照组外)在乙醚麻醉下，以血凝试验640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染，每鼠300,L(20个LD50致死量)观察感染后发, 百拇医药(邱召娟 朱萱萱 倪文澎 严士海)