防己黄芪汤防治肾间质纤维化的实验研究(2)
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1.3 实验模型制作 参照文献报道方法，将大鼠固定于手术台上，左侧腹部切开，分离左侧输尿管，丝线结扎两处，并在两处结扎点间剪断输尿管，制作UUO模型。假手术组仅开腹并游离左侧输尿管，但不结扎和剪断。
1.4 实验分组 大鼠随机分5组，每组8只，将假手术组作为正常对照，单侧输尿管结扎大鼠随机分为模型组、防己黄芪汤组、防己黄芪去甘草汤组(简称去甘草汤组)、蒙诺对照组。
1.5 给药方法 按《方剂学》中记录剂量按大鼠体表面积计算给药，即每天剂量为汉防己0.228g、黄芪0.285g、白术0.171g、甘草0.114g，去甘草汤组是在上述基础上去甘草，对照组给予蒙诺0.19mg(成人剂量10mg/天按大鼠体表面积计算)。煎成2mL汤药或溶解成2mL灌胃，假手术组和模型组以等量生理盐水灌胃。术前1天开始给药。
1.6 标本采集 术后14天将各组大鼠处死，股动脉取血，离心分离血清，用作生化检测；取术侧肾组织一半置于10%福尔马林固定液中，作病理切片和免疫组化实验，另一半置于液氮中冷冻保存，以备作RT-PCR检测。
1.7 肾组织病理观察 将10%福尔马林固定的肾组织常规石蜡包埋切片，经HE、Masson染色后，采用北京航天大学医学图像采集及分析系统，光镜下观察并采集MASSON染色肾脏病理图像，蓝色为纤维化阳性染色区。每张切片随机采集5个不重叠视野，分别测量每个视野中肾小管间质纤维化阳性染色的相对面积，取平均值。
1.8 免疫组化 采用SABC法，2%牛血清白蛋白代替一抗作为阴性对照。光镜下采集免疫组化图像，棕黄色为阳性染色，每张切片随机采集5个不重叠视野，分别测量每个视野中肾间质阳性染色总面积，取平均值。
1.9 RT-PCR 检测Trizol法提取总RNA，两步法进行逆转录和聚合酶链扩增反应(RT-PCR),β-action作为内参照，引物序列见表1。PCR反应条件为：95℃ 5min,95℃30s，50～60℃ 30s，72℃30s，共35循环，72℃ 10min。扩增产物经1.7%琼脂糖凝胶电泳后，BIO-RAD紫外凝胶成像系统成像，用quanity one软件对特异性条带进行半定量分析，结果以目的条带与内参照β-action条带的积分光密度之比值表示。
1.10 统计 各组数据用平均数±标准差(±s)表示 ......
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