益肾调经方对雷公藤多苷致性腺抑制的肾病大鼠子宫内膜bck-2/bax基因表达的影响(2)
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1 材料与方法
1.1动物
雌性SD大鼠50只，8周龄，体重180～200g/只。
1.2药物
YSTJF水煎浓缩液(主要由淫羊藿、菟丝子、肉苁蓉、补骨脂、黄芪、枸杞子、女贞子、川牛膝、丹参、制香附等组成。本院制剂室制备)高压灭菌，置冰箱4℃下保存备用；雷公藤多苷片(10mg/片，江苏南通制药厂生产，批号050312)；结合雌激素(商品名：倍美力0.3mg/片，艾尔斯特制药厂生产，批号0404154)；阿霉素(10mg/瓶,浙江海正药业股份有限公司，批号：050402)。
1.3分组及给药方法
大鼠随机分为7组。①正常对照组(n=6)：每日蒸馏水灌胃。②肾病模型组(n＝8)：予阿霉素5mg/kg尾静脉一次注射。③性腺抑制组(n=8)：予阿霉素5mg/kg尾静脉一次注射，注射后喂养3天，再予雷公藤多甙片80mg/(kg•d)。③YSTJD水煎液高、中、低剂量组(n均为7)：予阿霉素5mg/kg尾静脉一次注射，注射后喂养3天，再予雷公藤多甙片80mg/(kg•d)，并予YSTJD水煎浓缩液含生药分别75、50、25g/(kg•d)[即分别24、16、8mL/(kg•d)]合用每日灌胃。④阳性对照组(n=7)：予阿霉素5mg/kg尾静脉一次注射，喂养3天后予雷公藤多甙片80mg/(kg•d)和倍美力0.02mg/(kg•d)合用每日灌胃。该实验共8周，于用药结束后第2天处死大鼠，立即摘取子宫，置于液氮中保存。
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1.4观测指标及测定方法
RT-PCR方法检测bcl-2/ bax在子宫内膜上的表达。
1.4.1 总RNA的提取
依照Trizol Reagent使用说明书进行。
1.4.2 引物
bcl-2、bax、β-actin引物均根据PRIMER5.0引物设计软件自行设计，再由上海生物工程公司合成。bcl-2上游引物为5-cac ccc tgg cac ttc tcc ttc-3 Bcl-2，下游引物为5-cac aat cct ccc cca gtt cac c-3，扩增片段大小为302bp；Bax上游引物为5-gac acc tga gct gac ctt gg-3，下游引物为5-gag gaa gtc cag tgt cca gc-3，扩增片段大小为402 bp；β-actin上游引物为5-cca acc gtg aaa aga tga cc-3，下游引物为5-cag gag gag caa tga tct tg-3，扩增片段大小为712 bp。
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1.4.3 RT-PCR
依次按照下列反应条件扩增：95℃ 5min变性，56℃ 20s退火，72℃ 10min；共35个循环。扩增产物置于4℃备用。
1.4.4PCR产物半定量分析
(1)PCR产物行1.4%的琼脂糖凝胶电泳：DNA的琼脂糖凝胶电泳和上述RNA琼脂糖凝胶电泳一致，PCR产物上样量为10μL。
(2)凝胶图像采集及半定量分析：用Bio-Rad凝胶图像分析系统对电泳条带进行扫描分析，结果用目的基因/β-actin积分光密度值表示目的基因的相对表达量，积分光密度值＝(条带灰度-背景灰度)×面积。
1.5统计方法
计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，以P<0.05为有统计学差异，按完全随机设计资料的方差分析用SPSSfor Windows 13.5软件包进行统计。
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2 结 果
2.1 益肾调经方对性腺抑制大鼠子宫内膜bcl-2 mRNA表达的影响
性腺抑制组bcl-2 mRNA含量减少，与正常对照组比较P0.05。结果见表1与图1~2。
2.2益肾调经方对性腺抑制大鼠子宫内膜bax mRNA表达的影响
性腺抑制组bax mRNA含量增高，与正常对照组比较
P0.05。结果见表1与图3～4。
3 分析与讨论
雷公藤有活血化瘀、清热解毒、杀虫止血等功效。雷公藤多苷具有抗炎、抗免疫活性，其对增生活跃的卵泡细胞有细胞毒作用，阻止卵泡发育，使体内E2水平过低，反馈性刺激垂体产生FSH升高[2]，在形态学方面的影响主要表现为子宫的萎缩、子宫重量下降以及卵巢重量指数下降等[3]。笔者的实验研究说明益肾调经方可以通过对抗子宫及卵巢重量指数的下降，提高E2、P的水平，改善子宫内膜
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ER、PR、GnRHR的表达，改善子宫、卵巢的病理学变化，防治雷公藤多苷导致的性腺抑制，且作用呈剂量相关性[1]。
细胞凋亡在维持子宫内膜正常周期性变化中起着重要作用[4]，子宫内膜细胞凋亡受凋亡相关基因调控，与性激素及其受体、细胞因子、酶的作用有关。细胞凋亡失常是功能失调性子宫出血、不孕症、流产、子宫内膜癌、子宫内膜异位症、子宫腺肌病等疾病的病理基础。bax/bcl-2是一对凋亡调控基因，前者促进细胞凋亡，后者抑制细胞凋亡。检测二者的mRNA在子宫内膜上的表达，能反映出子宫内膜细胞的损伤情况，笔者的实验结果显示：性腺抑制组的bcl-2 mRNA含量降低，bax mRNA含量升高，说明性腺抑制的病理条件下会导致子宫内膜过度凋亡。而益肾调经方能够降低baxmRNA在子宫内膜的表达，并能提高bcl-2mRNA的表达，通过调整bcl-2/bax比例对
由雷公藤多苷导致的性腺抑制有一定防治作用。其作用机制尚待于进一步探讨。
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参考文献
[1] 毛黎明，程晓霞，王华杭，等.益肾调经方防治雷公藤多苷致雌性肾病大鼠性腺抑制的实验研究[J].中医药学刊，2006，24(12)：2261-2263.
[2] 顾江红，何嘉琳，汪明德，等.雷公藤治疗子宫内膜异位症40例临床观察[J].中国中医药科技，2003，10(5)：302.
[3] 唐永，张霞.雷公藤在皮肤科应用中的不良反应(附163例临床分析)[J].临床皮肤科杂志，1998，27(6)：37.
[4]王锦华，邱如卿.细胞凋亡与子宫内膜的关系综述[J].福建中医学院学报，2005，14(1)：56-58., 百拇医药(毛黎明 殷子杰 王 军 程晓霞)