华蟾素调控VEGF/VEGFR-2信号传导抑制肿瘤血管生成的研究(2)
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微血管密度计数方法：先在低倍镜下(100倍)确定3个CD34阳性着色最密集的区域，然后在高倍视野(200倍)下计数微血管，取3个视野的均值作为微血管密度(MVD)。肿瘤内硬化区域和肿瘤细胞稀少区域内的微血管不进行计数。
(3)免疫组化法检测VEGF表达。采用免疫组化(SABC)法检测瘤组织VEGF表达，实验方法同上。结果判定：VEGF表达定位于肿瘤细胞胞浆与胞外，呈棕黄色细颗粒状。将染色结果用Image-Pro Plus4.5图像分析软件进行分析，每1切片在200倍视野下随机选择5处，计算阳性区域平均光密度值。平均光密度值(mean optical density， MOD)=积分光密度值(integrated optical density，IOD)/面积(area)，所有数据取均值并分析统计。
2.2 体外实验
2.2.1 细胞处理取处于4～6代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)接种传代，培养24h后，分为5组，除正常组直接加入生理盐水外，其余均加入4ng/mL VEGF，同时分别加入生理盐水，参一胶囊100μg/mL、华蟾素0.1μg/mL，即正常组(N.S组)、对照组(N.S+VEGF组)、参一组(Rg3+VEGF组)、华蟾素组(HCS+VEGF组)。上述各组孵育48h后，PBS冲洗1遍，胰酶消化，用冷PBS中和后，离心洗2遍，放置-80℃冰箱保存。
2.2.2Western Blotting法检测VEGFR-2(KDR)表达 Western Blotting步骤根据参照文献[3]包括：(1)膜蛋白提取；(2)蛋白质电泳；(3)电转膜、杂交；(4)暗室中X光片曝光2h；(5)X光片显影、定影。
2.2.3图像处理及统计分析用Image-Pro Plus4.5图像分析软件测定Western blot条带的净OD值(Net Intensity，NI)以各泳道条带OD值与对应的β-Actin组条带OD值的比值(相对OD值)来计算检测蛋白的表达量。各组数据采用±s表示，采用t检验，应用SPSS10.0统计软件分析。以P<0.05为有显著性差异。
3结果
3.1华蟾素对Lewis小鼠的抑瘤作用
见表1。
表1实验结果显示：参一组可增加Lewis小鼠体重，与生理盐水组比较差异明显(P<0 ......
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