1.4 实验动物分组与处理

    成年健康雄性Wistar大鼠购自广州中医药大学实验动物中心,参照改良的Longa栓线法构建大鼠MCAO(局灶性脑缺血)模型。模型评分由专人进行盲法评估,模型成功判断标准参考Zea Longa[4]评定神经功能缺损程度法判断,模型制备完成后神经学症状评分高于1分纳入实验。将36只成功的MCAO大鼠随机分为模型组和电针任脉组,每组又分为7天、14天、28天3个亚组,每个亚组各6只。

    电针任脉组于注射病毒后第2天开始电针治疗。参照《实验针灸学》(上海科学技术出版社,1999年9月第1版)选取任脉“关元、气海、承浆”穴,电针刺激10min,1天1次。电针仪采用上海医疗电子仪器有限公司制造的G6805-Ⅱ型电针治疗仪,电针负极同时接关元、气海两处,正极接承浆。模型组大鼠只予以同等条件抓取固定。

    1.5 取材与观察

    对到达时相点的大鼠采用心脏灌注固定法处死,取脑后行冰冻切片,片厚20um,将切片置于共聚焦显微镜下照相,用Leica图像分析系统采集图像并统计计数。

    1.6 Nestin免疫荧光鉴定NSC

    将上述观察后的切片入PBS冲洗,入过氧化氢后继续PBS冲洗,入50%甲酰胺(formamide)/2×枸橼酸钠杂交液(SSC)和PBS分别反复冲洗,经HCL处理后入硼酸缓冲液冲洗,以牛血清蛋白(BSA)封闭非特异性抗原,加入小鼠Nestin单克隆抗体过夜,继续PBS冲洗,加入羊抗小鼠IgG-Cy3红色荧光二抗(1∶400),PBS反复冲洗后裱片,甘油封片 ......