①肺组织的收集:大鼠浸泡于75%的酒精中3min后,在无菌室里,打开胸腔,结扎右主支气管,左肺行肺泡灌洗。分离右肺,生理盐水中漂洗干净,置10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24h,在最大横径处切取3mm厚组织固定,常规脱水、透明、浸蜡和包埋等制作成石蜡组织块和切片备用。

    ②BALF的收集:大鼠放血完毕后在无菌条件下行支气管肺泡灌洗。在超净工作台内无菌条件下,仰卧固定,颈部正中切开皮肤,钝性分离并暴露气管,右主支气管结扎后,在环甲软骨处剪一“V”形小口,将塑料套管(管径约1.5mm)插入气管,沿气管向肺部推进约1.5cm到左主支气管,用线结扎固定。大鼠处于头低脚高位(放于冰块上),用无菌注射器吸取4℃生理盐水(NS)3mL,将注射器与塑料套管相连,在30s～1min内将NS缓慢注入肺内,使NS液在肺内停留约30s,轻揉胸廓缓慢回抽灌洗液,再将所得液体缓慢注回肺内,如此反复3次,盛入15mL的离心管中,此为第1次灌洗,然后重复共5次上述操作,将灌洗液集于同一离心管中总量约15ml(回收率均>85%),取少量显微镜下计数细胞。其余BALF经无菌双层纱布过滤后移至无菌离心管中,离心(4℃,1000r/min,10min),取上清液5mL,放入-20℃冰箱保存备待测。

    1.2.4标本检测

    ①光学显微镜观察肺组织结构变化:石蜡切片的HE染色(苏木素-伊红染色);石蜡切片的Masson染色。

    ②病理形态学定量分析 组织病理学的病变程度:根据Szapiel等[2]的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度,并参照张动伟等提供的标准将肺泡炎和肺纤维化分级并计算积分,进行病理半定量分析 ......