桃核承气改良方对家兔血管内皮损伤后PDGF-B和VEGF影响的实验研究(2)
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Key words:Taohe Chengqi improved side; vascular endothelial; PDGF-B; VEGF
冠脉再狭窄是一种医源性疾病,在临床中屡见不鲜,而PCI术后再狭窄的机制主要为血栓形成、炎症反应、血管平滑肌增殖、细胞外基质及胶原纤维过量增生、血管重塑等。PDGF通过一系列复杂的作用网络,最终形成动脉粥样硬化特征性斑块,导致再狭窄的发生;而VEGF通过一系列复杂的作用网络,最终促使新毛细血管生成和其功能成熟。有鉴于此,本文旨在探讨核承气桃改良方对PDGF、VEGF的影响,从而预防冠心病经皮冠状动脉介入治疗技术术后冠脉再狭窄。
1 材料与方法
1.1 实验材料
动物及饲料:健康新西兰大耳白兔40只,体重2～2.5kg,由辽宁中医药大学实验动物中心提供。家兔普通饲料、家兔高脂饲料(基础饲料79%、15%蛋黄粉、猪油5%、胆固醇1%)均由辽宁中医药大学动物实验中心加工。
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主要试剂及仪器:PDGF-B 抗体, SA1020 免疫组化染色试剂盒,均由武汉博士德生物公司提供,SN～695型智能放免r测量仪,上海原子核研究所日环仪器一厂生产。SANYO MDF～382E超低温冰箱(日本三洋公司)恒温水浴箱、SmartView2001生物电泳图像分析软件鼠抗人单克隆抗体COX—2(GT201202),购自Gene公司,封闭用正常山羊血清工作液,总RNA提取试剂异硫氰酸胍(美国Invitrogen Life technologies公司),反转录酶(AMV), RNA酶抑制剂,dNTP混合液,Oligo(dT)15,Taq DNA聚合酶,目的基因引物(日本TaKaRa公司)考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程公司)碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(北京中山生物技术有限公司)PCR扩增仪(德国Biometra), Chemi Imager5500凝胶电泳成像分析系统(美国Alphainnotech chemi Imager)。
1.2 实验方法 实验分组及药物制备:实验分组:健康新西兰大耳白兔40只,将动物随机分模型组、中药组、西药组、空白组,每组10只;桃核承气改良方(大黄30g,芒硝15g,甘草15g,肉桂15g,桃仁15g,水蛭25g,金银花20g),由辽宁中医药大学附属第一医院提供。药物用水浸泡0.5h,先武火再文火煎1h,倒出药汁,共煎3次,将药汁合并,过滤,浓缩至100mL(相当于生药1.35g/mL),4℃冰箱保存。舒降支40mg/片,批号:由杭州默沙东制药有限公司提供。阿司匹林100mg/片,由拜尔药业集团有限公司提供。研磨后,双蒸水溶解,4℃冰箱保存。
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动物造模:动物造模:除空白组外的3组动物高酯饲料喂养4周造成动脉粥样硬化模型[2],然后行腹主动脉内膜剥脱术造模:25%乌拉坦腹腔注射0.4mL/100g麻醉家兔,于右侧腹股沟部进行脱毛消毒后利多卡因少量局麻,切皮拨肉分离股动脉,两动脉夹分别夹住股动脉近心远心端暴露2cm左右,剪开动脉周长三分之一口,用6F穿刺针刺破动脉壁,经导丝导入直径1.5~2.0mm球囊导管(依血管直径大小而定),至肾动脉下方,盐水充盈球囊(压力为4~6kPa),缓慢回拉导管至切口处抽空球囊内液体,使压力降至零,重复上述过程3次,达到剥落腹主动脉内皮的目的。撤出导管,结扎股动脉,缝合皮肤,术后3天每天连续肌注青霉素80万U/只,预防感染。
实验取材:术后4周处死家兔,切开腹壁暴露腹腔,将肠管翻至一侧,分离腹主动脉,截取2cm长腹主动脉用生理盐水冲洗后放于10%的中性甲醛溶液中-20℃贮存。
1.3 指标测定 ①PDGF-B半定量RT-PCR:取实验兔的血管内皮组织200mg。测定mRNA;参照说明。引物COX-2和β-actin内参对照引物由中国医科大实验室提供。参照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA。参照RT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应。取 5μL PCR产物与2μL上样缓冲液混合,进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳 (120V, 45min),电泳结束后,凝胶成像仪成像分析。中药对动脉壁PDGF-B含量影响[2]取腹主总动脉,制成石蜡切片,3 % H2O2灭活内源性酶10min ,加复合酶消化液置8min ,滴加正常山羊血清封闭液置20min ,加PDGF-B 链单克隆抗体,4℃过夜,次日加生物素化山羊抗鼠/ 兔IgG,37℃反应40 min ,滴加试剂SABC ,37℃反应30 min ,显色,脱水,中性树胶封固。新生内膜部位棕黄色颗粒为PDGF-B 染色阳性信号。在400倍光镜下,随机选取5 个视野,按染色颗粒多少及染色强度进行半定量分组定分: Ⅰ组(分值1分),所有视野未见阳性表达颗粒; Ⅱ组(分值2分),3～4个视野有少数阳性表达颗粒; Ⅲ组(分值3分),3～4 个视野有较多阳性表达颗粒,1～2 个视野则少数; Ⅳ(分值4分),所有视野均有较多阳性表达颗粒,2 个以上视野有较多强阳性表达颗粒。
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②Western Blot印迹分析VEGF蛋白表达:参考试剂盒说明。
1.4 数据处理采用SPSS 10.0软件统计学处理,数据以平均值±标准差(±s)表示,计量资料组间用ANOVA,两组间比较用q检验,计数资料率用χ2检验,P<0.05为差异有显著。
2 结 果
2.1 PDGF-B免疫组化结果见图1。
免疫组化染色图象分析结果:阳性颗粒主要表达部位在腹主动脉内膜内皮细胞胞浆,动脉中膜及内皮下的平滑肌细胞胞浆有少量表达。空白组内膜很薄,在腔面只见一层内皮细胞核,内弹性膜呈波浪状,与中膜分界明显;模型组内膜增生严重,内弹力板不连续,内膜增厚处向腔内呈丘状或扁平状隆起,大量平滑肌细胞排列紊乱和大量泡沫细胞积聚;中药组、西药组与模型组比较内皮连续、增生减低。说明桃核承气改良方能使兔腹主动脉内膜损伤后内膜增生减低 。
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2.2 兔腹主动脉内膜剥脱术后28天各组动脉壁PDGF-B 含量 见表1。
结果显示,模型组血管壁PDGF-B 含量明显增加。中药组和西药组均使血管壁PDGF-B 含量下降,中药组和西药组无显著差异。
2.3 家兔血管内皮中VEGF的mRNA半定量RT-PCR结果 见图2。在不同试验组兔子血管内皮中,均可见到VEGF的mRNA表达。其中,模型组中VEGF的mRNA表达上调;中药组,化学药组VEGF的mRNA表达被抑制。Western Blot结果量化分析,见图3。采用FlourChem V2.0凝胶成像分析软件(America)分析,记每条蛋白电泳带的灰度值,进行定量分析。结果表明STAT3和VEGF的蛋白表达明显减少,和对照组比较差异具有统计学意义。
3 讨 论
冠脉再狭窄是一种医源性疾病,通常在PCI术后3~6个月发生,单纯球囊扩张后发生率30%~50%[1];冠脉金属裸支架置入术后10%~40%的患者可发生支架内再狭窄[2];药物洗脱支架如雷帕霉素洗脱支架的再狭窄发生率仍有5%~10%[3]。研究表明,PCI术后再狭窄的机制主要为:血栓形成、炎症反应、血管平滑肌增殖、细胞外基质及胶原纤维过量增生、血管重塑等。, 百拇医药(王 健 宫丽鸿)