补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的影响(2)
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参见附件。
1.3 分组处理
随机分为5组,所有动物均常规喂养。假手术组(12只):手术时只分离腹主动脉,不用银夹缩窄,手术4周后,双蒸水灌胃1.5mL/100g体重,1次/日,连续4周。模型组(12只):造模4周后,双蒸水灌胃1.5mL/100g体重,1次/日,连续4周。卡托普利组(12只):造模4周后,卡托普利灌胃100mg/kg(相当于成人80～160倍),1次/日,双蒸水稀释,连续4周。补肾复方大剂量组(12只):造模4周后,补肾复方口服液(生药含量24g/kg体重,相当于成人16倍),1次/日,灌胃,连续4周。补肾复方小剂量组(12只):造模4周后,补肾复方口服液(生药含量12g/kg体重,相当于成人8倍),1次/日,灌胃,连续4周。
1.4 观察指标
1.4.1 左室重量指数(LVMI) 迅速取出心脏,沿房室交界处去除左右心房及大血管,去除右心室游离壁,将左心室加室间隔用JA1003型电子天平准确称重(上海精科天平厂生产的)作为LVM,并计算按照左室重量(mg)/体重(g)公式即左室重量指数(‰)作为左室肥厚的指标。
1.4.2 左室心肌病理形态胶原染色 试剂配制:Ponceau's染色液400mL(0.5% Ponceau's水溶液40mL,苦味酸饱和水溶液360mL);Victoria blue'B染色液400mL(Victoria blue'B2.0g,70%乙醇400mL)。染色方法:组织切片脱蜡至水;70%乙醇稍洗后,入Victoria blue'B染色液中15min;95%乙醇中分化数秒钟;用蒸馏水洗2次;用Ponceau's染色液滴染2min;直接用无水乙醇分化与脱水;二甲苯透明;中性树胶封固。观察方法:在光镜下观察[3]。
1.4.3 左室心肌间质超微结构 将大鼠迅速处死后,取左室心肌固定于pH7.4二甲砷酸钠配置的2%戊二醛溶液内,经取材心肌缓冲液冲洗后再固定于10%锇酸溶液中,按电镜常规技术脱水、包埋,用LKB Ⅴ型超薄切片机作超薄切片,经醋酸钠与枸橼酸铅双重染色,在日本电子1200EX透射电镜下观察并照像,并重点观察心肌细胞间胶原纤维的改变。
1.4.4 左室心肌Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及图像分析 石蜡切片,片厚5μm;二甲苯脱蜡;经各级酒精至水;0.2%胃蛋白酶溶液37℃1h;双蒸水洗涤5min×3次;0.6%过氧化氢—甲醇溶液37℃ 30min;双蒸水洗涤5min×3次;PBS洗涤5min×3次;加正常血清室温下20min;加第一抗体(1:100Ⅰ型胶原抗体)37℃1小时,4℃过夜;PBS洗涤5min×3次;滴加即用型envision置37℃烘箱40min;PBS洗涤5min×3次;加DAB溶液光镜观察下显色;水洗;0.5%甲基绿染色;用蒸馏水洗3次;37℃烘干,二甲苯透明;封片[4]。用石家庄华行医疗器械厂与河北医科大学联合生产的ZL2000细胞分析仪进行图象分析。
1.4.5 左室心肌Ⅲ型胶原免疫组织化学染色及图像分析 除第一抗体为1:100Ⅲ型胶原抗体外,余同Ⅰ型胶原。
1.5 统计分析
用SPSS 11.5统计软件进行统计处理,定量资料以均数±标准差(±s)表示。实验组和对照组之间比较采用两独立样本t检验,以P≤0.05表示差别有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
共有16只死亡,死后均有尸体解剖。假手术组1只因肠梗阻死于术后第4天;模型组中有3只死于术后2天之内,经证实均死于急性心功能衰竭;卡托普利组2只死于术后3天肠梗阻,2只死于术后2周后慢性心功能衰竭。补肾复方大剂量组、补肾复方小剂量组均有4只死于术后2天之内,经证实系死于急性心功能衰竭与术后肠梗阻。
2.2 左室重量指数(LVMI)
压力负荷增加大鼠各组左室重量指数的改变见表1,图1。模型组LVMI(‰)明显高于假手术组(P<0.01),补肾复方大剂量组、补肾复方小剂量组明显低于模型组(P<0.01)。
表1 压力负荷增加大鼠
各组左室重量指数的改变(±s)
组别nLVMI(‰)
假手术组112.11±0.14
模型组92.98±0.36**
卡托普利组82.32±0.35##
补肾复方大剂量组82.35±0.39##
补肾复方小剂量组82.42±0.35##
注:与假手术组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01。
2.3 左室心肌病理形态胶原染色
假手术组在心肌细胞间仅有少许鲜红色胶原纤维。模型组在心肌细胞间有大量的鲜红色胶原纤维存在。卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组的改变与假手术组基本相似,见图1。
假手术组左室心肌病理形态胶原染色(×200)
模型组左室心肌病理形态胶原染色(×200)
卡托普利组左室心肌病理形态胶原染色(×200)
补肾复方大剂量组左室心肌病理形态胶原染色(×200)
补肾复方小剂量组左室心肌病理形态胶原染色(×200)
图1 左室心肌病理形态胶原染色
2.4 左室心肌间质超微结构
假手术组心肌细胞间仅有少许胶原纤维沉积。模型组心肌细胞间有较多的胶原纤维沉积。而卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组心肌细胞间胶原沉积明显减少,以补肾复方大剂量组减少最为显著,见图2。
2.5 左室心肌Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及图像分析
压力负荷增加大鼠各组左室心肌Ⅰ型胶原的改变见表2。模型组Ⅰ型胶原的平均光密度与假手术组比显著升高(P<0.01),卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组的Ⅰ型胶原平均光密度均较模型组显著下降(P<0.01)。
表2 压力负荷增加大鼠各组左室
心肌Ⅰ Ⅲ型胶原平均光密度的改变(±s)
组别nⅠ型胶原平均光密度Ⅲ型胶原平均光密度
假手术组80.1246±0.00500.1109±0.0024
模型组80.1575±0.0025**0.1378±0.0066**
卡托普利组80.1284±0.0051##0.1164±0.0033##
补肾复方大剂量组80 ......
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