艾灸任脉经穴对脑缺血再灌注大鼠组织超微结构及巢蛋白表达的影响(2)
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由于脑缺血本身诱导的神经干细胞较少,故探讨上调内源性神经干细胞的方法成为目前研究的热点。祖国医学认为,任脉不但是治疗中风的常用经穴,同时亦具有调节胚胎发育的作用。以此思路为指导,笔者推论艾灸任脉经穴能够促进脑内的神经干细胞增殖,从而促进脑缺血损伤修复。本实验旨在观察艾灸任脉经穴对脑缺血损伤修复作用,并进一步从干细胞角度探讨其作用机制,为临床治疗脑缺血提高疗效及认识任脉的实质提供新的理论依据。
1材料与方法
1.1实验动物及分组 SPF级成年健康雄性SD大鼠72只,由广州中医药大学实验动物中心提供,粤监证字2007A024。实验前体重(250±10)g,饲养环境:室温 22℃,相对湿度 55%,12h昼夜节律,实验大鼠均自由进食及饮水,适应环境 1周后开始实验。术前禁食12h,随机分为假手术组(sham operation group, Sham)24只、模型组(MCAO group, MCAO)24只、艾灸任脉组(moxibustion Ren vessel treated group, R)24只。每组再分别随机分为7天组、14天组和28天组3个亚组。
1.2局灶性脑缺血大鼠模型的建立 大鼠以3.5%水合氯醛腹腔麻醉(lmL/l00g体重),应用日本制尼龙线(直径0.235 mm)阻断右侧大脑中动脉血流,缺血2h后再灌注。参考Longa神经病学评分[5]评定神经功能缺损,评分为1～4分则造模成功,用于实验。假手术组仅分离右侧颈总动脉并离断右颈外动脉,不予栓塞。
1.3治疗参数 艾灸任脉组(R):大鼠手术后24h予艾灸任脉经穴,取穴依据《实验针刺学》(上海科学技术出版社,1999 年9 月第1版)选取气海、关元两穴处剪毛,艾灸时将大鼠固定,局部碘酊消毒,用自制艾柱(长度约10cm,直径约0.8cm)
在穴位上方2～3cm处悬灸大约10min,采用温和灸补法,以大鼠出现疼痛及抽搐为度,每日1次至动物处死。假手术组(Sham)和模型组(MCAO)于术后第2天将其如艾灸任脉组大鼠般固定于操作台上20min,并不作任何治疗。
1.4电镜观察组织超微结构 各组大鼠分别于再灌注后7天、14天及28天心脏灌注处死取脑,以手术刀片将纹状体部分切出大小1mm×1mm×1mm块状,置入2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定2h以上;0.1M PBS冲洗3次,每次10min;1%锇酸固定90min;0.1M PBS冲洗3次,每次10min;梯度酒精脱水:50%→70%→80%→90%→95%,漂洗1次,每次10min,再入100%乙醇2次,每次10min;无水丙酮:10min×2次;渗透、Epon、包埋剂∶丙酮=1∶1,1h(摇);纯包埋剂6h或过夜;聚合24h,60℃;用超薄切片机将组织块切成60～80nm厚的超薄切片;置菲利普 CMIO电镜下观察网孔中细胞形态及其超微结构的改变并摄片(中山医科大学电镜室)。
1.5 Nestin免疫测定各组大鼠分别于相应时间心脏灌注处死,于脑立体定位仪上行脑冠状切并取脑,将含侧脑室的组织置于4℃4%多聚甲醛中后固定6h,然后将组织块脱水、透明、浸蜡。组织蜡块以1μm冠面切片,用浸泡过多聚赖氨酸的玻片裱片,并行烤片、脱蜡、水化、自来水冲洗;加入3%H2O2室温下孵育20min以灭活内源性过氧化物酶,然后放入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复,滴加5%牛血清白蛋白封闭液,室温下放置20min,甩去多余液体,不洗,滴加巢蛋白免疫组化单克隆抗体(MAB-0566 ,迈新公司),4℃下过夜,次日PBS冲冼3次×5min,除去PBS液,每张切片滴加50μL即用型MaxvisionTM试剂,室温下孵育10～15min;PBS冲冼3次×5min,除去PBS液,每张切片加100μL新鲜配置的DAB溶液,显微镜下观察3～5min。自来水冲洗,苏木素复染,PBS冲洗返蓝;切片经梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.6图像分析与统计学处理 采用德国Leica DC software数码图像分析系统进行图像分析。光镜下(20×10倍),每张切片于缺血侧侧脑室下区选取5个相邻视野,以Nestin阳性染色细胞数平均数作为指标,进行阳性细胞计数。
数据分析采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析多样本均数间多重比较,对资料方差齐性进行Levene检验,按α=0.10水准,若方差齐,则应用Least Significant difference t检验(LSD-t检验)来判断差异的统计学意义,P<0.05认为差异具有显著性;按α=0.10水准,若方差不齐,则应用Cochran & Cox近似t检验来判断差异的统计学意义,P<0.05认为差异具有显著性。
2 结 果
2.1组织超微结构观察 Sham组:纹状体神经元细胞核核膜完整、清晰,核仁明显,染色质均匀分布。胞浆中线粒体结构正常、有板层样嵴和管状嵴,嵴结构完整。粗面内质网丰富、结构完整。神经胶质细胞结构正常。微血管管腔大小正常,内皮细胞光滑,基质膜完整。MCAO组及R组:缺血侧纹状体神经元可呈不规则形,甚者细胞核固缩,核膜迂曲并可见连续性中断,核仁边移,染色质团块状凝集于核膜下,胞质可见灶状破坏溶解。部分神经元出现凋亡小体。神经胶质细胞也有类似改变。微血管内膜变平,严重者内皮细胞挛缩呈锯齿状改变,管腔明显狭窄或闭塞,管周围结构可见破坏溶解。缺血后相同再灌注时间组间观察比较发现,R组较同时相MCAO组有较多正常细胞保留,且细胞形态较接近正常见图1～3。
2.2 Nestin免疫测定结果 Nestin免疫阳性细胞表现为胞浆阳性,阳性的胞浆呈棕黄色染色。Sham组随着再灌注时间的延长,阳性细胞计数组间差别无统计学差异(P=0893,P>0.05)。MCAO及R组随着再灌注时间的延长阳性表达呈减弱的趋势。再灌注7天时阳性表达最高,14天时表达减弱,28天时阳性细胞计数最少。再灌注7天,MCAO组阳性细胞数明显多于同时相Sham组(P=0000, P<0.01),且明显低于同时相R组(P=0.003,P<0 ......
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