莪术油对大鼠乳腺癌癌前病变组织中VEGFmRNA表达的影响(2)
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参见附件。
1.3 实验仪器 OLYMPUS(BH-2)照像显微镜、光学显微镜，隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS)，LEICARMZ135切片机，微复移液器，WT11001R型电子天平，HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统。
2 试验方法
2.1 分组造模及给药方法275只SD大鼠随机分为7组；(1)空白对照组；35只，一次性灌胃生理盐水1mL/100g；(2)疾病模型组；40只，一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g)；(3)莪术油小剂量治疗组；40只，一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g)，第2天开始莪术油1mL/100mg腹腔注射4周；(4)莪术油中剂量治疗组；40只，一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g)，第2天开始莪术油2mL/100mg腹腔注射4周；(5)莪术油大剂量治疗组；40只，一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g)，第2天开始莪术油4mL/100mg腹腔注射4周；(6)康莱特治疗组；40只，一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g)，第2天开始康莱特2mL/100mg腹腔注射4周；(7)三苯氧胺治疗组；40只，一次性灌胃DMBA100mg/kg(1mL/100g)，第2天开始三苯氧胺2mL/100mg灌胃4周。造模及给药后各组动物均常规饲养。
2.2 取材及制片(1)动物观察时点及每批处死动物数量(表1)。(2)取材：脱毛剂将大鼠胸部鼠毛去除，1%戊巴比妥钠按40mg/kg经腹腔注射麻醉后，取大鼠胸腹部第4、5、6对乳腺及其周围皮肤、皮下组织约1.0cm×1.0cm。
(3)标本经中性福尔马林固定梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片。
2.3 原位杂交 检测VEGF原位杂交试剂盒采用针对大鼠VEGF的寡核苷酸探针，经地高辛标记，可以检测出福尔马林固定，石蜡包埋标本的VEGF之mRNA序列。针对大鼠的VEGF靶基因的mRNA序列为：
杂交步骤及杂交后检测程序均按试剂盒说明书进行。杂交时设阴性对照。杂交阳性信号为细胞核和浆内棕黄色细颗粒。
2.4 结果判定方法(1)大鼠乳腺组织病理学诊断标准按2003WHO乳腺肿瘤病理与遗传学分类。(2) VEGFmRNA阳性细胞在细胞核表达棕黄色颗粒。高倍镜下选择阳性细胞较多的区域采集3～5个光镜视野，输入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统内，在相同的背底和倍体条件下选择相应的参数，进行计算机完全定量分析。阳性细胞阳性率=阳性目标面密度/(阳性目标面密度+阴性目标面密度)。阳性细胞阳性率<10%为(-)，>10%为(+)。
2.5 统计方法采用SAS 8.0版统计软件分析，检验标准α=0.05。计数资料用χ2检验;计量资料结果用均数±标准差(±s)表示，先进行方差齐性检验，组间差异采用两两q检验。
3 结 果
3.1 各试验组中正常乳腺普通增生非典型增生癌组织中VEGF mRNA表达阳性率及表达强度(每例标本的VEGF mRNA阳性细胞阳性率) 均呈递增趋势，见图1～2。
3.2 大鼠不同类型乳腺组织各试验组VEGF mRNA表达阳性率 见表2。普通增生乳腺组织中，各干预组与造模对照组之间VEGF mRNA表达阳性率无显著性差异(P>0.05)。非典型增生乳腺组织中，各干预组VEGF mRNA表达阳性率均明显低于造模对照组(P<0.05)，各干预组之间VEGF mRNA表达阳性率无显著性差异(P>0.05)。
3.3 各试验组中大鼠不同类型乳腺组织中VEGF mRNA表达的阳性细胞阳性率 见表3。各组非典型增生组织中VEGF mRNA表达的阳性细胞率明显高于普通增生(P<0.05)。各组全部非典型增生样本中，各干预组VEGF mRNA阳性细胞阳性率均明显低于造模对照组(P<0.05)。莪术油3种剂量组均低于康莱特及三苯氧胺对照组(P<0.05)。莪术油小、中、大3种剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。三苯氧胺与康莱特组之间无显著性差异(P>0.05)。
3.4 大鼠非典型增生乳腺组织中VEGF mRNA阳性标本的阳性细胞阳性率 见表4。VEGF mRNA表达阳性的样本中，各干预组VEGF mRNA阳性细胞阳性率明显低于造模对照组(P<0.05)。莪术油3种剂量组均明显低于康莱特及三苯氧胺对照组(P<0.05)。三苯氧胺组与康莱特组之间无显著性差异(P>0.05)。莪术油小、中、大3个剂量组VEGF mRNA阳性细胞阳性率呈递减趋势，大、小剂量组之间差异显著(P<0.05)。
4 讨 论
WHO2003乳腺肿瘤组织学分类明确的将非典型增生归属为乳腺癌前驱病变。乳腺癌癌前病变的研究与血管生成、细胞凋亡的研究紧密联系。血管生成(angiogenesis)与乳腺良性疾病恶变、肿瘤的发生、发展、转移和预后均有密切的关系[6]。既往在血管生成与乳腺癌癌前病变的实验中发现，从轻度非典型增生、中重度非典型增生到乳腺癌，各组血管密度(MVD)逐渐增高，研究证实乳腺癌癌前病变与血管生成的关系。
血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的促进肿瘤血管形成的因子。VEGF又称为血管通透因子，它是内皮细胞的特异性有丝分裂源,也是一种有效的血管形成和通透性诱导因子。其能产生多种生物学效应的细胞因子，在胚胎组织中有广泛表达，当血管形成后，正常生理状态下被关闭。因此，正常成人组织呈低水平表达。但在病理情况下可出现VEGF的异常表达，在肿瘤组织中肿瘤细胞侵入的巨嗜细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移[7]。
研究采用中药莪术油、康莱特及三苯氧胺，早期干预DMBA诱导的大鼠乳腺癌前病变造模组织中VEGFmRNA的表达，从抗血管生成的角度来纠正非典型增生阶段失衡，以期能够早期干预或逆转乳腺癌前病变降低乳腺癌的发生。
莪术油的多靶点抗肿瘤机制包括直接细胞不良反应、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞DNA合成及核酸代谢、诱导细胞凋亡、提高机体免疫保护效应等。笔者既往研究发现莪术油能够降低DMBA诱导大鼠乳腺癌前病变模型中血液黏度，提高微循环灌注量，其效果优于康莱特和三苯氧胺对照组[8]。本研究结果显示，莪术油低、中、高3个剂量组对于正常乳腺组织及普通增生乳腺组织中VEGFmRNA的表达无影响，但能够显著降低非典型增生乳腺组织VEGFmRNA表达阳性率和表达强度。在降低VEGFmRNA表达强度方面，莪术油组效果优于康莱特和三苯氧胺组，尤其对于VEGF表达阳性的标本，表达强度降低更为显著，并且呈剂量依赖效应，莪术油大剂量组明显优于小剂量组。莪术油能够有效的降低DMBA诱导大鼠乳腺癌前病变组织中VEGFmRNA表达强度，抑制血管生成，为临床治疗乳腺非典型增生提供了一个有效的方法，对乳腺癌的二级预防具有重要的临床意义 ......
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