纤维素酶水解栀子苷的工艺条件研究(2)
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参见附件。
2.2水解产物的鉴别和测定
2.2.1溶液的配置
对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品2.7mg，置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，得浓度为108μg/mL的对照品储备溶液，再精密吸取2mL于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得浓度为54μLg/mL的对照品溶液。精密称取栀子苷元对照品6.17mg，置于100mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，得浓度为61.7μLg/mL的对照品储备液。
供试品溶液的制备：供试品溶液A:精密称取制备的栀子苷元样品约0.6mg，置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度线，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，HPLC待测栀子苷元纯度。供试品溶液B：经无水乙醚萃取的栀子苷的酶水解液，1mL于水浴上挥干，再以1mL甲醇溶解，为供试品。
2.2.2 栀子苷元的薄层鉴别
精密称取约0.5g的栀子苷和1g的纤维素酶，加入pH=5.1的醋酸缓冲溶液50mL，于磁力加热搅拌器上反应2h，反应温度为50℃，放冷后用无水乙醚萃取3次(50mL×3)，合并乙醚层溶液，取1mL于水浴上挥干，再以1mL甲醇溶解为供试品B；以栀子苷和栀子苷元的对照品溶液，分别点样5μL于GF254薄层板，以乙酸乙酯∶氯仿∶甲酸(6∶3∶1)为展开剂，于紫外灯254nm下检视。结果见图1。
A-栀子苷对照品B-栀子苷元对照品C-样品(自制栀子苷元)
图1 栀子苷元薄层鉴别图
结果显示：酶解产物主斑点为栀子苷元，基本没有其他副产物。
2.2.3栀子苷元的HPLC测定
参照2005版《中华人民共和国药典》紫外测定附录项下[5]。精密称取1mg栀子苷元于25mL容量瓶中，甲醇定容，并以甲醇为空白对照，于200～400nm范围内作波长扫描,栀子苷元在238nm处有最大吸收。
色谱条件：色谱柱Kromasil C18 5μm 100A(250mm×4.6mm)，流动相为乙腈-水(15∶85)；检测波长为238nm；柱温30℃；流速1mL·min-1 ；进样量20μL。
取栀子苷元对照品溶液和供试品溶液A进行测定，得栀子苷元的保留时间约为14.28min，峰形良好，理论塔板数达到要求。
2.2.4栀子苷元的纯度测定
按最佳条件，制备3批栀子苷元样品，测得纯度为97.3%。证明纤维素酶水解栀子苷，所得栀子苷元纯度较高，产量稳定，水解工艺合理可行。结果见表4。
3 讨 论
由栀子苷制备栀子苷元可采用酸水解法或酶解法。本研究曾对这两种实验方法的进行了比较，考察了反应温度、反应时间、pH值等影响因素。结果表明：酸水解所得的苷元晶体非常有限，而且副产物较多，主要原因是可能是因为栀子苷为环烯醚萜苷类，易被水解，生成的苷元为半缩醛结构，其化学性质活泼，容易进一步聚合，因此难以得到结晶苷元。而纤维素酶水解栀子苷产物的TLC薄层图中，主斑点为栀子苷元，表明该酶解反应主要产物为栀子苷元，副产物少。因此，酶解反应专一性较好，作为制备栀子苷元的主要方法。
酶解法反应温度对产物的量影响较大，但温度过低或过高，都不利于反应进行。低于45℃条件下，栀子苷酶解后栀子苷元的产率较低，所以经乙醚萃取后得到的晶体非常有限，因此推测在低温下环境下，纤维素酶的活性较低，无法有效地水解栀子苷中的苷键；65℃条件下的水解反应，由于温度较高，水解反应液呈蓝黑色，经乙醚萃取后，乳化现象非常明显，静止24h后也未分层，萃取难以实现；55℃时，结晶产物较多，但也出现一定程度的乳化现象，故综合考虑，以反应温度在50℃左右为宜。
酶解法反应时间与产物的量呈正相关，时间越长，栀子苷元的产量也越大，但是反应时间过长，从2.5h后，萃取就比较难以实现，3h、4h乳化现象非常严重，难以达到油水分离，较难实现栀子苷元的制备。为了提高栀子苷元得率和操作的可行性，反应时间选择1.5~2h为宜。
在考察pH值的影响作用过程中，当pH值为8的缓冲溶液，乳化非常严重，不易分离，未得到结晶；pH值为3.8的缓冲溶液，无结晶析出。故以pH值为5.7~4.3范围内进行实验考察。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:科学技术出版社,1998:15-29.
[2] 朱振家,钱之玉,陆莉华,等 ......
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