大萼香茶菜甲素对多发性骨髓瘤细胞株U266体外作用的研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
细胞活率：方法同细胞计数。在药物分别作用24h后各组细胞用P I染色,用流式细胞仪检测104个细胞,计数其活细胞(PI-)百分比，实验重复3次。
细胞形态观察：方法同细胞计数。在药物分别作用24h 和48h后取各浓度组细胞，离心涂片，常规瑞氏染色后镜下观察细胞形态变化。
1.4 MA对U266细胞生长影响的MTT测定 取对数生长期细胞,将其浓度调整为2.0×105/mL ,接种于96 孔板,每孔200μL ,分别与终浓度为(2、4、8)μg/ mL 的MA共培养,以未加药的U266 细胞为对照,每组设3个平行孔，置37 ℃、5 %CO2 饱和湿度条件下进行培养,分别于24、48、72h加入5 mg/ mL 的MTT 溶液(20μL/ 孔) ,继续培养4 h后离心去上清,加入终止液DMSO 溶液150μL/ 孔,振荡10 min,在酶标仪上用双波长(492 nm 和630 nm) 测吸光值(OD 值) ,以吸光值为纵轴、作用时间为横轴绘制细胞增殖曲线。取48 h的OD 值计算各组的细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率( %) = (1 - 用药组平均OD 值/ 对照组平均OD值) ×100 % ,实验重复3 次,取均值。
1.5 AnnexinV /P I方法检测细胞凋亡 检测方法参照试剂盒说明书进行。设立3个药物浓度组，每组MA终(质量)浓度分别为(2、4、8)μg/ mL，并设不加药的空白对照组。每瓶体系5mL，培养12h后，轻轻离心去上清，将细胞稀释于binding buffer液中，调整细胞浓度至1×106/mL；加入5μL Annexin V和5μL PI,避光于冰上反应15 min。流式细胞仪检测,重复实验3次。
1.6 细胞DNA倍体检测 分组方法同AnenexinV /PI标记,培养24h后,离心弃上清,用PBS洗涤1次,加入50μL DNA - Prepkit透膜剂,轻摇1min后加入碘化丙锭染液500μL,室温避光10min后,流式细胞仪检测104个细胞以上,并用Muticycle软件进行DNA倍体分析,计算亚二倍体峰(subG1)的百分率。
1.7 Western免疫印迹法检测20s蛋白酶体亚单位β1、β1i、β2、β2i、β5、β5i的变化 分别收集经(0、2、8)μL/ mL MA及10μL/ mL DMSO(溶剂对照组)处理48h后的U266细胞，同时设置空白对照，提取总蛋白。测定蛋白浓度, 取20μg等量蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳。然后转至PVDF 膜上。用含5%的脱脂奶粉室温封闭2h后, 加入适量浓度的一抗, 4℃过夜。室温下用TBST洗3遍,每遍15min，摇床轻摇；泡二抗2h,再洗膜3遍(同样每次15min，摇床轻摇)。滴加ECL化学发光试剂，X 光片曝光、显影和定影。β-actin作为内参对照。
1.8 Western免疫印迹法检测NF-κB、IκB-α蛋白表达 实验分组、药物作用时间和Western blot方法同材料和方法7。
1.9 统计学分析 统计分析用SPSS 16. 0统计软件包进行统计分析，结果用±s表示,多组间比较进行单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验,P< 0. 05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MA对U266细胞增殖的抑制作用 MA抑制U266细胞生长：细胞经大萼香茶菜甲素作用24h，48h后，随着剂量增加和作用时间延长，细胞活率显著减弱，细胞增殖明显受到抑制，呈现剂量和时间的量效关系，见插页Ⅱ图1，图2。
(2、4、8)μg/mLMA作用U266细胞24h后PI染色细胞活率分别为83.2%、54.7%、35.9%，空白对照为98.0%，DMSO组为97.5%。
图2 不同浓度大萼香茶菜甲素作用U266细胞24h后PI测定结果
2.2MTT法检测MA对U266细胞抑制增殖的效应
不同浓度的MA对U266细胞生长均有抑制作用,呈现时间与剂量的依赖关系, 24、48h的IC50分别为(4.6、3.9)μg/mL。在药物作用48h后, 8μg/mL 组抑制率到达83%，见插页Ⅱ图3。
3MA诱导U266细胞凋亡
3.1 细胞形态学观察 U266细胞经MA 4μg/mL作用48h后，瑞氏染色光镜下观察细胞，出现核固缩、核边聚、核碎裂、胞膜出泡，可见典型的凋亡小体，见插页Ⅱ图4。
3.2 AnnexinV /PI检测 U266细胞与不同浓度(2、4、8μg/mL)的MA培养12h后,早期凋亡细胞(Annexin v+ /P I- )与总凋亡率(Annexin v+ /P I- 与Annexinv+ /P I+之和)随着药物浓度的增加而增加,与药物剂量存在着显著的量效关系。见表1、图5。
3.3细胞DNA倍体检测 MA与U266细胞作用24h后，细胞DNA倍体分析显示细胞凋亡率与药物剂量存在着显著的量效关系。见表1、图6。(2、4、8)μg/mLMA作用后亚二倍体比率分别为4.5%、17.3%、50.7%；空白对照为3.05%。
3.4Western免疫印迹法检测20s蛋白酶体亚单位β1、β1i、β2、β2i、β5、β5i、的变化 U266细胞经(2、8)μg/mL的MA作用48h后β1、β1i、β2、β2i、β5、β5i亚单位的降解情况，见图4。β1、β2i、β5亚单位没有被降解；而β1i、β2、β5i亚单位则随MA的浓度而被显著降解，见图7。
达下调；而IκB-α表达则上调，见图8。
4 讨论
目前，对天然中草药抗肿瘤的研究越来越多，本研究中大萼香茶菜(MA)是一种从香茶菜属植物中提取的二萜类化合物[5]，其中的α亚甲基环戊酮基团被认为是抗肿瘤的活性基团[6]。多发性骨髓瘤(MM)是异常浆细胞单克隆恶性增生性疾病, 目前难以治愈 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3035kb)。