超微四逆汤对大鼠的长期毒性试验(2)
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参见附件。
取四逆汤传统饮片，用纯净水配制成4.28g/mL，置4℃冰箱保存备用。
2.2 动物分组、给药、饲养与抽样
取SD大鼠92只，体重(100±20)g，雌雄各半，按性别、体重分层随机分成4组，各给药组雌雄各12只，对照组雌雄各10只，分开饲养，每笼5~6只，喂全价颗粒饲料，饮冷开水；实验室温度22～25℃，湿度50%～70%。实验室温度与湿度用专用表格逐日记录。
取其中1组大鼠作为对照组给纯净水，取其中3组分别为四逆汤传统饮片、四逆汤超微饮片低剂量组、四逆汤超微饮片高剂量各1个组。四逆汤超微饮片低剂量为21.4g/kg，四逆汤超微饮片高剂量为42.8g/kg；四逆汤传统饮片组42.8/kg，给药，体积为10 mL/kg，每天1次，共给药12周。每周根据体重变化调整每只大鼠给药体积1次。
末次给药后，取四逆汤传统饮片组、四逆汤超微饮片低剂量组、四逆汤超微饮片高剂量组，以及对照组，随机各取雌、雄各6只，夜间禁食，自由饮水，次日进行指标检测。剩余大鼠停药观察2周，同法进行指标检测。
2.3 检测指标
2.3.1 一般观察指标给药期间，每日观察动物存活、行为、活动、毛色、精神状态、粪便状况；每周用电子秤称动物体重1次，并根据体重调整饲料量；每周称剩余饲料量并计算平均每日每只大鼠饲料消耗量。
2.3.2 血细胞检测颈动脉取血约2mL至EDTA-2K抗凝带盖锥型试管中，用全自动血细胞分析仪测红细胞计数(RBC)及红细胞压积(Hct)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞分布宽度-变异系数(RDW-CV)，血红蛋白(Hb)及平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，白细胞计数(WBC)及淋巴细胞百分率(LYPHM)和中性细胞百分率(NEUTRO)，血小板计数(Plt)及平均血小板计数(MPV)、血小板分布宽度-变异系数(PDW-CV)。
2.3.3 血清生化检测颈动脉取血约2 mL，室温下放置1h，4000r/min离心10min，分离血清，用全自动生化分析仪按试剂盒说明书规定的检测方法测血清GLUC、PROT、ALB、CHOL、TBIL、ALT、AST、ALP、CR、BUN，按下述公式计算血清球蛋白(GLOB)和白(蛋白)球(蛋白)比值(A/G)。
2.3.4 心电图检测 用标准Ⅱ导联记录大鼠心电图,定标电压1mV=10mm ,计算PR 间期、QRS间期、QT间期、T波和心率等指标。
2.3.5 统计分析方法数据以±s表示，采用SPSS 11.0软件包分析处理；方差齐时，采用方差分析(最小显著差法，LSD)，不齐，则采用近似方差分析(Tamhane′s T2)。
3 结 果
3.1 对大鼠一般情况的影响
四逆汤传统饮、四逆汤超微饮片低剂量(21.4g/kg)、四逆汤超微饮片高剂量(42.8g/kg)灌胃给药12周和停药2周，对大鼠行为活动、毛色、大小便、饮水、精神状态均无明显影响，眼、鼻、口腔无异常分泌物；试验期间，大鼠未出现异常死亡。
3.2 对大鼠体重的影响
与纯净水组比较，给药12周和停药2周，四逆汤超微饮片低剂量组(21.4g/kg)，四逆汤超微饮片高剂量、四逆汤传统饮片(42.8g/kg)剂量组灌胃对大鼠总体重均无明显影响(P>0.05)，见表1。
3.3 对大鼠饲料消耗量的影响
与纯净水组比较，给药12周和停药2周，四逆汤超微饮片低剂量组(21.4g/kg)，四逆汤超微饮片高剂量、四逆汤传统饮片(42.8g/kg)剂量组灌胃对大鼠饲料消耗量无明显影响，见表2。
3.4 对大鼠血液学各指标的影响
与纯净水组比较，给药12周和停药2周，四逆汤超微饮片低剂量组(21.4g/kg)，四逆汤超微饮片高剂量、四逆汤传统饮片(42.8g/kg)剂量组对红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、白细胞(WBC)及分类(中性NEUT、淋巴LYM)、血小板(PLT)、凝血时间等指标均无明显影响(P>0.05),结果见表3、表4。
与纯净水组比较，给药12周和停药2周，四逆汤超微饮片低剂量组(21.4g/kg)，四逆汤超微饮片高剂量、四逆汤传统饮片(42.8g/kg)剂量组对谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BL)、总胆固醇(TCH)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)等指标均无明显影响(P>0.05),结果见表5、表6、表7、表8。
3.5 四逆汤超微饮片对心电图的影响
与纯净水组比较，给药12周和停药2周，四逆汤超微饮片低剂量组(21.4g/kg)，四逆汤超微饮片高剂量、四逆汤传统饮片(42.8g/kg)剂量组对心率、PR、QRS、QT间期和T波均无明显影响。结果见表9、表10。4 讨 论
运用高新技术生产的中药超微饮片是新近发展起来的一种新型饮片，该剂型是将中药饮片粉碎成微粉并制成颗粒，按中医处方配药，不需煎煮，直接冲服。其特点是饮片经粉碎成微粉后，细胞基本都已破壁，提高了比表面积、有效成分溶出度、生物利用度，因而能提高药效、减少用量、节省药材、保护药材资源；同时便于服用，并可实施大规模工业化生产[1-6]，有利于中医药事业的可持续发展。
四逆汤出自《伤寒论》,由附子、干姜、甘草组成。具有回阳救逆之功效，现广泛用于心肌梗死、心力衰竭、急慢性胃肠炎吐泻过多、或某些急证大汗出而见休克，属亡阳虚脱者的抢救治疗。四逆汤作为临床急救用药，要求服用方便、吸收强、起效快，而传统方剂则要求附子久煎30min以上，这显然与急救用药的特点不相符合。如果把四逆汤开发为超微制剂，一冲即服，方便、快捷，超强吸收，迅速起效则更有利于参附汤用来救治急、危重病人。但是作为毒性药物的附子，超微粉碎后其活性成分是否发生了变化？是否会引起新的不良反应或不良反应？作为临床上需久煎来减毒的附子是否同其他超微饮片一样只需80℃温水冲泡十几、20min就可服用？其不良反应是否加大？因此在四逆汤开发为超微制剂之前必需对其安全性给予科学的评价。
本研究给药12周和停药2周，四逆汤超微饮片(D90为75μm)对动物行为、活动、毛色、大小便、饮食、饮水无明显影响，眼、鼻、口腔无异常分泌物出现；对红细胞、血红蛋白和血小板、凝血酶原时间无明显影响；对血液生化学指标亦无明显影响；对大鼠脏器系数、组织形态学和组织病理学影响不明显，表明四逆汤超微饮片无明显毒性反应。
四逆汤传统饮片推荐成人平均每日用量为30g，四逆汤传统饮片组按体重折算相当于70kg成人日用量的100倍，按体表面积折算相对于70 kg成人日用量的15.85倍；四逆汤超微饮片推荐成人平均每日用量为15g，四逆汤超微饮片低、高剂量(D90为75μm)按体重折算分别相当70kg成人日用量的100、200倍；按体表面积折算 ......
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