肝纤维化病证结合模型的研究思路(2)
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3 肝纤维化病证结合模型的建立方法及评价
3.1 肝纤维化病证结合模型的构建思路
肝纤维化病证结合模型复制的文献报道极少，复制过程基本分为两方面：一是疾病模型复制；二是中医证模型复制。张斌等[6]采用复合多因素的造模方法，在DMN制作大鼠肝纤维化模型的同时，多次静脉给予去甲肾上腺素和小牛血清白蛋白联合造成大鼠血瘀型肝纤维化模型，通过对该证的体征观察及肝脏病理组织学观察显示该模型既具备肝纤维化的病理特征，又符合中医血瘀证的证候表现。
有关病证结合动物模型的复制主要有两种思路。一是指在中医理论指导下，结合现代医学理论与实验动物科学知识，分别或同时采用传统中医学病因复制证候动物模型和采用西医学病因复制疾病动物模型，使模型动物同时具有疾病与证候的特征。如1993年陈小野[7]报道，采用耗气破气法与饥饱失常法联合作用复制小鼠脾虚证模型，在此基础上采用醋酸法复制胃溃疡模型，从而制成病证结合的胃溃疡模型。1999年王健等[8～9]采用饮食不节、疲倦、惊恐、寒湿及高脂饮食等多因素作用于老年大鼠，通过结扎两侧颈总动脉复合制作气虚血瘀证大鼠脑缺血模型，并用具有益气活血功效的中药复方脑络通反证取得了满意效果。2004年杨倩春等[10]在大鼠慢性肾炎造模过程中，进行了游泳疲劳试验，取得了慢性肾炎气虚血瘀证模型。由于该思路符合中医理论且模型可控性较好，为多数学者采用，张氏等即采用了这种思路。二是设想在西医病的模型基础上，不施加人为干预因素，在疾病模型建立过程中或建成后，观察并检测疾病模型是否具备中医证的特点(如寒热、虚实、阴阳、血瘀等)，即观察疾病在形成过程中证的演变过程及疾病模型制成后表现的中医证型建立病证结合模型。如2000年丰平等[11]利用S180腹水瘤建立小鼠实体瘤，进行血瘀证有关指标检测，评价其作为病证结合血瘀证模型的意义。2002年王硕仁等[12]通过结扎左冠状动脉致心力衰竭的大鼠模型，运用中西医结合虚证和血瘀证的全国统一诊断标准、建立并评价心气虚病证模型。2004年富琦等[13]应用抗血清免疫法造免疫性血小板减少性紫癜病，并观察各组大鼠病理及中医证候的变化。该类模型在一定程度上避免了过多人为因素的干扰，但模型可控性差，操作难度大，可行性不强。
3.2 肝纤维化病证结合模型的制作方法
我们在复制肝纤维化病证结合模型时，基本上分为两个层面，第一肝纤维化疾病模型的复制，第二中医证候模型的复制，二者有机结合，尽可能使肝纤维化病证结合模型符合临床实际。
3.2.1 肝纤维化病的模型复制 利用CCL4进行肝纤维化模型的制备是经典的药物毒性肝纤维化模型。实验中采取40%CCL4橄榄油油剂按照0.3mL/100g体重皮下注射，每周2次，经过病理学检测，肝纤维化程度稳定。这是由单一因素所造成的动物模型，病理改变干扰因素较少，可控性较好，较往常利用复合因素(高脂饮食、酒精性等)形成肝纤维化模型有着显著的优点。病理学改变早期以脂肪病为主，逐渐可见肝组织内有肝细胞变性坏死。
但是CCL4所致肝纤维化模型制备过程中的高死亡率及具有自愈的倾向一直是实验中的难点。从实验一开始对大鼠的实验数目加以控制是对付死亡率过高最好的手段。同时CCL4所致肝纤维化模型与人类肝纤维化的病理改变有着一定的差别，所以在实验中肝纤维化模型形成后(6周)必须定期给予大鼠一定量的微量CCL4持续刺激，以维持肝纤维化的病变。持续刺激的时间间隔和持续刺激的量是本动物模型中的关键技术，持续量过大或间隔时间过短将会导致纤维化程度加重，甚至肝硬化，反之则大鼠自愈倾向明显，容易产生阴性干扰因素从而造成实验失败。经皮下注射的CCL4油剂在皮下可以产生一定量的结节，随着时间的增加，结节由于不断地被吸收逐渐缩小，实验中主要以大鼠皮下结节大小来控制大鼠持续刺激的间隔时间，刺激量基本上控制在0.3mL/100g的剂量。实验证明肝纤维化的模型基本上符合临床及以往国内文献报道。不失为一种较为成功的肝纤维化模型。
3.2.2 肝纤维化病证结合模型的复制 采用的是第一种思路，即中医学病因复制证候复加西医学病因复制疾病。在此思路下学者们又有先证后病、先病后证、证病同塑等不同。我们认为无论是病的模型还是证的模型，其基本特征之一就是模型与原型(病或证)之间有广泛的相似性，包括疾病的发生发展过程。关键要看是否符合临床实际，根据疾病临床实际发展情况塑造病证结合模型，既可用现代医学方法结合中医基础理论知识造模，亦可通过现代医学方法复加中医传统病因塑模，既可病证同塑，亦可先病后证或先病后证。我们根据临床肝纤维化的发生发展情况采用先病后证的造模方法，CCL4造模4周后复加中医干预因素。
肝纤维化肝郁脾虚证的造模法：肝郁证采用的是较为成熟的夹尾法。本法复制的机理是“怒伤肝，久则郁”，气机失调，渐至肝气郁结。夹尾造成疼痛的刺激，进而激怒全笼大鼠，致大鼠恼怒不堪，表现为相互撕咬，易激惹，前肢离地站立、相互对峙。随着刺激的延长，撕咬剧烈程度减弱，饮水和吃食也明显减少，甚至不思饮食，多呈困倦状态，毛发变暗、枯黄，体重下降。可以看出夹尾虽为肉体刺激，但影响精神活动的变化，渐渐演变为郁证。脾虚证采用的是生大黄水煎液灌服法。生大黄水煎液灌服的原因是，中医理论认为“吐下之余，定无完气”，表明泻下可以导致脾气虚。二种因素共同作用复制出肝郁脾虚模型。
肝纤维化气虚血瘀证的造模法：气虚血瘀证采用的是较为成熟的游泳疲劳法。中医理论认为，气为血之帅，气行则血行，气止则血止，气有一息之不运，则血有一息之不行。可见气与血关系密切，气虚可致血瘀。故本造模重点放在血瘀之根本原因-气虚的致病因素上。造模方法模拟了以下可导致气虚的因素：①“劳则耗气”。采用强迫游泳法让大鼠游泳14天，使大鼠处于高度应激状态，逐步耗气伤精。②“湿伤脾，寒伤肾”。游泳水温及室温均低于大鼠体温，且泳后不予保温措施和擦拭水迹，则通过寒、湿两种致病因素导致脾、肾二脏损伤，同时游泳不慎呛水和屏息一定程度上对肺脏也有损伤。③“忧思伤脾，惊恐伤肾”。任大鼠倾听同类在水桶中游泳挣扎声响，使其产生忧虑与惊恐的情绪，表现为全身颤抖，四肢蜷缩或躁烦乱窜，具有七情内伤作用。上述因素共同模拟中医气虚证的发生过程而导致大鼠气虚血瘀。
3.2.3 肝纤维化病证结合模型的评价 就病证结合的动物模型而言，成功的病证结合的模型应该部分的体现和能被研究者分析得到人类疾病和证型的特征。目前对于病的评价主要看肝组织病理学是否符合肝纤维化的病理学征象。中医证的评价方法主要靠符合中医病因的干预，且动物表现出符合中医证候学的特点，最好能通过药物反证表明造模的成功性。通过肝纤维化理化因素和模拟中医病因的干预的综合造模法，成功复制出中医病证结合模型。模型组肝组织病理HE示：大鼠肝组织汇管区和小叶内有明显碎屑坏死，部分出现桥接坏死，胶原纤维从中央静脉，窦周汇管区向外明显延伸，出现纤维间隔，部分假小叶形成。苦味酸—天狼红染色大鼠肝组织切片中可见汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，相邻汇管区延伸的纤维间隔部分连接。符合肝纤维化病理变化诊断标准。从大鼠的一般情况，宏观表现及中医病因干预因素，并进行了药物反证等因素上综合评价 ......
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