芹菜素对缺血缺氧脑损伤大鼠早期认知功能的影响(2)
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Key words:Apigenin；cognition；neonate rats；ischemic hypoxia brain damage；Morris water
脑性瘫痪是目前导致小儿残疾的主要疾病，发病率为1. 8‰~4. 0‰。脑组织在婴儿早期，尚未发育成熟，还处在迅速生长发展阶段，而脑损伤也处在初期阶段，异常姿势和运动还未固定化，所以这一时期脑的可塑性大，代偿能力高，恢复能力强。在这一时期及时治疗，可得到最佳治疗效果。
芹菜素是一种来源广泛的植物黄酮，其对中枢神经系统的作用有镇静、神经元的保护作用、抗氧化和抗脂质过氧化作用、诱导调亡、抗炎等[1]。神经节苷脂是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，在中枢神经系统中含量丰富，与突触传递、神经肌肉传递和细胞黏着有关。有关GM1用于新生儿HIE的治疗已取得确实的疗效，主要是通过减少兴奋性氨基酸、减少自由基损伤，起到稳定细胞膜，保护神经的作用[2]。本研究通过建立新生大鼠缺血缺氧脑损伤模型[3-4]，模拟围生期缺血缺氧脑损伤的病理改变，观察21日龄和31日龄大鼠的空间定位学习和记忆能力，以神经节苷脂GM1为对照，探讨芹菜素在神经保护、改善早期认知能力的作用及可能的机制，以期对改善认知的临床治疗提供参考。
1 材料和方法
1.1药物和试剂 芹菜素，分子量270.25，纯度99%，(批号：AP20070126，陕西慧科植物开发有限公司)；神经节苷脂GM1(单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液)，分子量 1568.84 or 1597.18，(国药准字：H20056783，齐鲁制药有限公司)。
1.2实验动物及分组10窝90只7日龄新生大鼠，每窝约8～10只新生鼠(带母鼠)，雌雄不限，体重12～18g，清洁级，由温州医学院实验动物房提供。每窝大鼠随机分为假手术组(Sham-operated，SH)、模型组(Model，M)、芹菜素干预组(Apigenin，A)和神经节苷脂GM1有效对照组(Ganglioside-GM1，GM1)。以上4组按后期水迷宫测试时间的不同各分为21日龄和31日龄两组。
1.3模型制备新生大鼠经10%水合氯醛(0.3～0.35mL·100g-1)麻醉后，固定、消毒，颈部正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉后一次性缝合切口。术后新生鼠开始活动后返回母鼠身边，次日再放入37℃的恒温密闭的透明缺氧瓶中，吸入8%的氧和92%的氮气的混合气体，缺氧1h后返回母鼠身边。假手术组模拟皮肤切开分离颈总动脉，但不结扎，随即缝合伤口，无缺氧，返回母鼠身边。
1.4 Morris水迷宫测试
1.4.1空间定位学习试验 每只大鼠进行每天3次的游泳练习，连续5天。记录大鼠找到隐匿平台的时间，记为逃避潜伏期，至120s找不到平台，将其引上平台，逃避潜伏期记为120s。大鼠每次爬上或被引上平台后，休息30s开始下一次训练。
1.4.2空间记忆试验 空间定位学习实验结束后，当天下午进行空间搜索实验，撤除平台，记录120s内穿过原平台位置的次数及台周Ⅰ区时间及路程，考察大鼠对原平台的记忆。
1.5 电镜和光镜
1.5.1取材行为学实验结束后，大鼠经麻醉、固定、灌注后，快速断头取脑，按照光镜和电镜的取材要求分别留取标本送检。
1.5.2 尼氏小体定量-神经细胞活力分析 镜下取每张大脑皮层5个视野(10×20)，然后用Image-pro plus5.0(IPP5.0)彩色医学图象分析系统统计每个视野的尼氏小体数目，用尼氏小体的数目/相应的面积来反映相应脑组织的神经元活力。
1.6统计学处理
数据以均数±标准差(±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett’T3检验。两样本比较采用t检验，相关分析采用 Pearson直线相关，率的比较采用χ2检验，当P<0.05认为差异有统计学意义，P>0.05认为差异无统计学意义。数据采用SPSS 11.5统计软件进行处理。2 结 果
2.1 脑组织肉眼观察
缺血缺氧实验各组出现缺血侧大脑肉眼明显萎缩改变的29只，约占51.8%(29/56)，未发现坏死液化灶形成。SH组脑组织未见萎缩或坏死液化灶形成。
2.2 尼氏染色光镜观察及尼氏小体定量-神经细胞活力分析
2.2.1 尼氏染色光镜观察 SH组的神经元细胞丰富且排列整齐有序，间质均匀；M组可见明显的胶质细胞增生，神经元排列不规则；A组和GM1组神经元细胞排列欠规则，较多见胶质细胞。
2.2.2 尼氏小体定量-神经细胞活力分析 A21组、M21组分别与SH21组比较有显著性差异(P<0.01)，GM1-21组与SH21组比较有显著性差异(P<0.05)；SH31组与M31组比较有显著性差异(P<0.01)。不同鼠龄间比较，各组均有显著性差异(P<0.01)。见表1。
2.3大鼠海马突触形态结构电镜观察
SH组见图1：突触联接较多，形态小。突触间隙不宽，界面平直，曲率较小。突触前膜内突触小泡数量一般，少见线粒体。致密板厚度一般。
M组见图2：突触结构正常，数量不多。突触间隙较正常组稍有变宽，界面曲度不大。突触前膜内突触小泡丰富，线粒体多见。致密板厚度一般。
A组见图3：突触形态较小，数量一般，可见U型突触，即突触前膜上有两个或两个以上的活性区的突触。突触小泡数量不多，但小泡直径较大，线粒体多见。致密板厚度均匀。
GM1组见图4：突触数量较多，形态正常；突触小泡密集，直径较小，可见线粒体；突触间隙宽度一般，致密板厚度一般。
2.4 空间定位学习成绩(平均逃避潜伏期)
经Morris水迷宫测试，M21组与各21日龄组间比较，A21较M21组有显著性差异(P<0.05)；
有显著性差异(P<0.01)；M21组较SH21组有显著性差异(P<0.01)；GM1-21组较GM1-31组有显著性差异(P<0.01)；M21组较M31组有显著性差异(P<0.01)；SH21较SH31组有显著性差异(P<0.05)。见表2。
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