抗淋巴细胞血清联合脾细胞促进异基因骨髓细胞形成嵌合体诱导免疫耐受(2)
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1 材料和方法
1.1 实验动物：BALB/c小鼠(H-2d)，供体小鼠，SPF级；C57BL/6小鼠(H-2b)，雌性，受体小鼠，SPF级；均15～20 g，浙江省实验动物中心提供，实验动物质量合格证：SCXK(浙)2003-0001号。
1.2 主要试剂及设备：PE标记的抗H-2d单抗(PE-抗H-2d单抗，eBioscience产品)，环磷酰胺(CP，江苏恒瑞医药股份有限公司)，低糖-DMEM(LG-DMEM，Gibco公司)，流式细胞仪(FACSCalibur，BD公司)，抗淋巴细胞血清(ALS)按文献[1]通过鼠脑免疫兔子制取兔抗小鼠抗淋巴细胞血清。
1.3 异基因骨髓细胞(BMC)的制备：BALB/c小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%酒精5min，取股骨、胫骨，剪去两端骨垢，用LG-DMEM培养基冲出骨髓，200目钢筛过滤制成单细胞悬液，红细胞裂解液去除红细胞，PBS离心洗2次，台盼蓝染色检测细胞活力在98%以上，制备成细胞悬液，室温下1h内使用。
1.4 异基因脾细胞(SC)的制备：BALB/c小鼠放血处死后，取脾脏于200目钢筛上研磨，培养基冲洗，过滤制成单细胞悬液，计数，稀释至所需浓度。
1.5 术前准备：第-7天，C57BL/6受体小鼠开始饮用含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的溶液，至第十二天为止。
1.6 耐受诱导和分组：第-5~-3天， C57BL/6受体小鼠每天腹腔注入0.5ml抗淋巴细胞血清(ALS)，共3天。第0天，C57BL/6受体小鼠通过尾静脉输注均源自BALB/c(H-2d)的1×108脾细胞(SC)及2×107骨髓细胞(BMC)。第二天， C57BL/6受体小鼠腹腔注射环磷酰胺(CP)200mg/kg。受体小鼠具体分组如下：第一组：无处理对照组；第二组：ALS+SC+CP；第三组：SC+BMC+CP；第四组：ALS+BMC+CP。第五组：ALS+SC+BMC+CP。每组5只或6只C57BL/6雌性小鼠。
1.7 皮肤移植：第六天按文献[2]进行尾-尾皮肤移植。供体BALB/c小鼠经麻醉后，尾全厚皮层切下面积约8 mm×5 mm，反转180度嵌于C57BL/6受体小鼠尾背距根部约10 mm处的植床上，塑料套管保护，将套管尾端用胶布缠成8字棍。4天后拆除套管，并观察移植皮片存活时间。皮片变硬、结痂、脱落、坏死为移植排斥；柔软或鼠毛生长为存活或耐受。每天观察移植皮片存活情况，共观察100天。
1.8 嵌合体测定：分别于BMC移植后30、50、70天，取第3、4、5组C57BL/6受体小鼠将其尾部距尾尖2mm处剪去，挤出尾静脉血50μl(肝素化)，加入PE-抗H-2d单抗1 μg/106细胞，温室避光20min，用红细胞裂解液裂解红细胞，PBS洗2次，上FACS检测其嵌合率，即测定BALB/c源性细胞的含量。
1.9 统计学方法：数据以x±s表示，进行t检验。
2 结果
2.1 异基因小鼠移植皮片存活情况：BALB/c供体小鼠移植皮片在C57BL/6受体小鼠上的存活情况见表1。
表1表明：第三组经SC+BMC+CP及第四组经ALS+BMC+CP处理后，皮片存活时间较第一、二组显著延长(P, http://www.100md.com(张文元 杨亚冬 房国坚 陈 勇)