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艾滋病实验诊断进展(2)
http://www.100md.com 2008年6月1日 《现代医药卫生》 2008年第11期
     3.3 定量PCR检测病毒载量:HIV载量指体内病毒复制的数量, 一般以血浆HIV RNA 的拷贝数表示;病毒载量定量检测具有十分重要的临床意义,Tetali等[7]通过测定HIV RNA的浓度,发现血浆中病毒载量度与疾病进展和存活率,通过bDNA和流式细胞仪进行检测,发现血浆中病载量与CD4 T淋巴细胞存在明显关系,呈负相关趋势,完全可作为HIV感染者观察病变的有效指标,尤其是HIV载量更具敏感性。目前主要有四种病毒载量定量PCR方法:bDNA、RT-PCR、NASBA及实时荧光定量PCR检测技术。

    3.3.1 bDNA是一种核酸检测技术:它属于信号扩增,而RT-PCR及NASBA检测属于靶扩增。bDNA检测中靶探针是与HIV基因组中的pol基因序列特异结合,此段序是所有已知的HIV基因组中最保守的区域。RT-PCR检测是通过逆转录(RT)及扩增(PCR)完成特异扩增HIVgag基因的一点长为142 bp的基因序列。由于每个样本中QS的量已知,运用公式算出HIV-RNA拷贝数从而达到HIV-RNA定量。NASBA检测是通过核酸释放提取(固有提取)、核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测(ECL)来完成对血浆血清中HIV RNA的定量。PT-PCA、NASBA属于PCA方法,其中包括抽提RNA的步骤,所以比较受污染而使RNA降解的bDNA RT-PCR,N ASBA有较好的稳定性、线性和可重复性。薛以乐等[8]通过实验比较bDNA与NASBA两处方法发现在检测HIV载量时具有高度一致性能,NASBA法HIRNA低浓度时敏感更高,bDNA法则能测得更广泛的亚型标本。
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    3.3.2 实时荧光定量PCR检测技术:其原理是使用荧光基团标记探针,5'端标记荧光基团,3'端标记淬灭基团,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光集团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板结合的位置处于上下游引物之间,利用Taq酶的5'-3'外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团的分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到,一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。上述荧光探针,称为TaqMan探针[9]。荧光实时PCR检测技术的应用,改变了传统的电泳终点检测,可以进行实时监控,得到非常好的S型扩增曲线。不但可以进行定性检测,更重要的是可以进行定量检测。样品中待测的DNA或RNA越高,则S型扩增曲线出现的越早,若有已知拷贝数的标准品,则可以得到未知样品的拷贝数。

    3.4 基因芯片应用于HIV检测:PRT440也广泛用于HIV-1的测序、分型及多态性分析[10]。但由于该技术较为复杂,且成本高,目前对其应用仍大多停留在实验阶段,离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。
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    4 病毒分离培养

    取新鲜分离的正常人淋巴细胞,用PHA刺激并培养3~4天,接合病人单个核细胞、骨髓细胞、血浆或脑脊液等标本进行培养。培养过程中需定期换液和补加经PHA处理的新鲜正常人淋巴细胞。培养2~4周后,如有病毒生长,则出现不同程度的细胞病变。最明显是出现融合的多核巨细胞。细胞病变出现后,可用间接免疫荧光法检测培养细胞中病毒抗原,或用生化方法检测培养液中的逆转录酶活性,以确定HIV存在[11]。

    5 CD4 T胞计数

    目前最常用的方法是仪器法(流式细胞仪检测)。HIV感染人体后的主要靶细胞是CD4淋巴细胞(也累及其它细胞)。一般认为在疾病早期CD4淋巴细胞>0.5×109/L,中期为0.2~0.5×109/L,晚期则为0.05~0.2×109/L,而终期可为<0.05×109/L[12]。曾惠云等[13]认为,CD4<100/ul细胞是病情进展或恶化的重要标志。鲍作义等[14]研究的结果显示,当CD4 T细胞数降到200个/mm3以下时,血液中病毒载量呈10倍增长。
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    综上所述,各种实验方法可以根据HIV感染的不同时期与状态选择不同的检测手段。HIV原发感染2周内,任何方法均无法检测到病毒,2周后出现病毒血症时,可检测病毒抗原,感染6~8周后可以选择检测抗体的方法。运用PCR技术可用来追踪HIV的自然感染史,可用来监测长期潜伏期(4~7years)患者以及在抗病毒治疗期间的病毒载量水平。也可用于HIV-I血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初6~9个月期间,他们的血清中存在母体的抗体,因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。就目前而言,标准的检测方法是血清学HIV抗体检测,它是诊断艾滋病感染者和艾滋病的主要指标和标准检测项目;分子生物芯片等更新检测技术可能会广泛应用于临床HIV检测,会有更多的新技术被应用到这一领域。HIV的实验室检测正朝着敏感、准确、快速、自动化方向发展,我们可以用更灵敏、准确、快速的方法对HIV感染作出诊断。

    参考文献:

    [1] 魏 民,邵一鸣.HIV实验室检测研究进展和发展趋势[J].国外医学病毒学分册,2003,10(3):65.
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    [3] 岑柳仙.HIV实验室检测概况[J].中国艾滋病性病,2006,12(2):192.

    [4] Bernard M,Branson MD.Rapid Test for HIV Antiboby [J].AIDS Re-views,2000,2:76.

    [5] 李敬云.HIV诊断试剂的发展[J].中国艾滋病性病防治,2001,7(1):54.

, 百拇医药     [6] Baumforth KR,Nelso PN,Digby JE,et al. demystified the polymerase chain reaction[J].Mol patho1,1999,55:10.

    [7] Tettale S,Bakshi S,Than S,et al.plasma virus load evauation in rela-tion to disease progression in HIV-infected children[J].Aids Res Hum-Retrorir,1998,14:571.

    [8] 薛以乐,郑小虹. HIV病毒载量定量测定方法的比较研究[J].伤害预防医学,2001,13(7):306.

    [9] 郑晓丽.HIV检测研究进展与发展趋势[J].现代检验医学杂志,2004,19(6):64.
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    [10] 刘彦华,仝文斌.生物芯片技术及其应用前景[J].中华医学检验杂志,2000,3:177.

    [11] 张卓然,倪语星.临床微生物学和微生物检验[M].北京:人民卫生出版社,2003.402.

    [12] 方 惠,薛以乐.HIV感染者病毒载量和CD4淋巴细胞的意义[J].上海预防医学,2001,7:203.

    [13] 曹惠云,黄世敬,黄霞珍,等.T淋巴细胞亚群与人AIDS存活时间的关系探讨[J].中国艾滋病性病,2004,10(3):169.

    [14] 鲍作义,李 林,庄道民,等.HIV感染者CD4/CD8细胞与病毒载量的关系[J].中国公共卫生,2003,19(11):1380.

    收稿日期:2008-01-29, http://www.100md.com(郭兆诚)
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