多重PCR技术在检测食源性病原微生物中的应用
[摘要]食品安全(Food safety)是当今共同关注的世界性公共卫生问题，对人们的日常生活影响巨大。其中由于病原微生物引起的食源性疾病又是食品安全中最重要部分，如何快速准确的检测出食品中病原微生物是保证食用健康食品的关键。多重PCR(Multiplex PCR)作为一种可同时检测多种目的基因的方法，在检测食品中病原微生物方面具有独特的优势，本文就近几年多重PCR在食品检验中方法建立以及应用研究予以综述。
[关键词]多重PCR；致病菌；病毒；真菌
[中图分类号]R372 [文献标识码]A [文章编号]1009-6019一(2010)05-84-03
多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增。根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增。前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增，后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增。与传统的PCR相比，具有扩增效率高，产物特异性高和经济简便特点，特别适合食品中病原微生物的快速测定。
, http://www.100md.com
1多重PCR在食品中致病菌的检测
目前多重PCR的方法主要建立在食品中病原菌的检测，这方面的研究最多，建立的方法也最多。
1.1多重PCR检测同一致病菌
食品中的某些致病菌由于具有较多的血清型，很多DNA片段都是某些细菌所共有的，很难通过单一的PCR扩增某条片段进行确定。极易造成测定结果的假阳性，影响样品检测的有效性。采用多重PCR针对目的基因的多个DNA片段设计引物进行扩增，根据多条扩增结果来判断结果可以减少假阳性，提高测定结果的特异性。
产毒素大肠杆菌是引起腹泻的重要致病菌，通常分为三种类型：ETEC(产肠毒素大肠杆菌)、SLTEC(产志贺样毒素大肠杆菌)和NTEC(产坏死性大肠杆菌)。其中SLTEC可产生三种毒素类型(sLTl、SLT2和SLT2v)，主要血清型是0157：H7 L2J。杨小鹃等采用大肠杆菌0157：H7rfeE和fliC基因的保守序列设计两对引物，通过对包括猪肉鸡肉牛肉羊肉在内的65份样品进行检测，同时采用传统分离培养鉴定和测序验证进行方法对比，结果显示阳性样品与标准鉴定方法的一致性达到98%，显示出测定结果的特异性好。
, 百拇医药
副溶血性弧菌主要存在于近海的海水、鱼类、贝类等海产品中的一种病原菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病等。在我国副溶血性弧菌引起的食物中毒在人数和起数上都处于第一位。李晓虹等根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计3对引物，采用PCR多重扩增，并对扩增结果特异性和标准菌株进行验证，结果采用多重PCR能够特异性的扩增副溶血性弧菌的450、269、500bp片段，而对其他种类菌没有特异性扩增。可在增菌8h后快速、简单、准确的检测出食品中副溶血性弧菌。 沙门氏菌(salmanella)是最常见食源性病原菌，所含细菌种类繁多。已发现超过2 500种以上的血清型。邵碧英等采用沙门氏菌属特异基因hut、hilA、invA、hns和hns 5个基因建立多重PCR检测方法，结果表明二重PCR检测灵敏度与单一PCR一致，三重PCR检测灵敏度有所下降。并未建立起同时检测4种基因的多重PCR方法。Soumet等根据沙门氏菌属随机克隆序列、伤寒沙门氏菌的fc基因和肠炎沙门氏菌的sefA基因设计了三对引物，应用多重PCR对1 078份家禽样品进行检测，敏感性可达95%，高于常规细菌学鉴定方法的92.5%。显示出方法建立的不稳定性和引物设计的重要性。
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1.2多重PCR检测不同致病菌
针对不同病原菌高度保守基因、特异性基因和毒素基因，设计相应的引物从而在同一反应体系中实现对多种病原菌的检测。可以大大缩短检测时间和降低成本。相对于检测同一致病菌，检测多种菌更有实际意义。由于食品中病原菌的数量较少，一般在检测前进行10～24h的增菌过程，可以显著提高样品检出率。陈伟等对金黄葡萄球菌(sA)的ntlc、单增李斯特菌(LM)的hly和蜡样芽孢杆菌(BC)的hemolysin基因，设计合成三对引物，结果显示方法检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同，结果稳定。具有推广应用价值。整个检测过程在16h完成，监测灵敏度可达1cfu/mL。李博等以金黄色葡萄球菌，志贺氏菌和沙门氏菌建立多重PCR获得相同的稳定结果。体现出在监测多重致病菌方面的优越性。杨平等对食品中主要存在的4种致病微生物沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，根据其主要特异性基因产物设计引物，建立起4种致病菌的多重PCR检测体系，体系中4种病原菌随机混合扩增均可成功，具有很强特异性，包括增菌时间10h即可检测完毕，在食品卫生检验中具有较强使用价值。焦豫良等对6种食品致病菌建立起的多重PCR灵敏度与单独PCR相同，所需时间更短，整个过程只需3-4h。显示出快速监测的优势。
, 百拇医药
2多重PCR在食品中病毒的检测
病毒只能在活的宿主细胞内才可以生存，一般在食品中并不能繁殖和复制，但很多资料证明，多种病毒性疾病确实由食品传播的。如甲肝病毒，脊髓病毒，轮状病毒和诺沃克病毒等。由于能够引起食品中毒的病毒种类较少，而且血清型亦不是很多，所以采用多重PCR测定多种病毒意义不大，但在确定食品中是否存在某种病毒方面具有一定的优势，即用多重PCR检测某一病毒，2003年SARS期间，我国出口的食品和动植物产品被迫要求进行SARS病原检测要求。单一PCR必须进行两次PCR才能确定是否为SARS。陈文炳等采用人工合成的特异的SARS病毒DNA片段作为可以病毒添加到牛肉等食品中，然后采用公开发表合成的引物进行二重PCR扩增，并采用单重PCR对照分析，得到相同的灵敏度，获得和单重PCR相同的扩增片段。给食品中病毒的多重PCR检测提供了一个研究方向。
3多重PCR在食品中真菌污染的监测
, 百拇医药 真菌在谷物和其他食品中生长繁殖时会产生真菌毒素，真菌毒素会引起人畜严重的食物中毒，如何能够快速检测食品中真菌及其毒素对于食品卫生具有重大意义。对于真菌的检测，目前多采用化学色谱法、现代免疫学和毒理学试验等，大部分是针对其产生的毒素进行鉴定，而对于未开始产毒或产毒量小的真菌检测可能出现假阴性。多重PCR通过检测真菌的基因序列判断食品被真菌污染的程度，具有更高的检出率，检测食品更加安全。秦文彦等t13J根据黄曲霉毒素生化途径中的关键调控基因an、Romt—1和ver-1的序列以及真菌共有的5.8SrDNA的ITS序列分别设计ApaF/ApaR、OmtF/OmtR、VerF/VerR及ITSl/ITS4 4对引物，研究建立起产黄曲霉毒索真菌及在食品中的快速灵敏监测体系，扩增出的对应基因序列与基因库中对应的DNA序列同源性达99%以上，监测特异性较好，提示多重PCR可作为真菌及其毒素检测的潜在方法进行研究。
4存在的问题与展望
多重PCR作为一种快速、准确、灵敏的检测方法，但高灵敏往往伴随着稳定性低重复性差的问题，PCR技术本身对操作者和试剂要求较高，多重PCR的要求则更加苛刻。微量的外源DNA即可对结果产生巨大的影响，甚至产生假阳性，导致测定结果错误。同时多重PCR对引物的浓度，Mg2’离子的浓度、dNTPS浓度和扩增退火温度的要求更加严格，任何一种条件控制不当，都很容易造成非特异性扩增，甚至扩增失败。在建立方法时必须进行优化各个反应条件，使得测定结果更加稳定和清晰。
虽然存在上述问题，多重PCR作为一种快速检测食品中多重病原微生物的方法，具有无比的优越性，随着实验条件的逐渐优化，新的靶基因提取技术出现及各种技术的整合和发展，如将多重PCR和DHPLC，荧光探针定量技术和PCR—DGGE等技术相结合，形成一套完整的分子生物学检测体系。使检测方法具有更高的特异性，灵敏性和稳定性。, 百拇医药(安利伟 陈 蕊)
[关键词]多重PCR；致病菌；病毒；真菌
[中图分类号]R372 [文献标识码]A [文章编号]1009-6019一(2010)05-84-03
多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增。根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增。前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增，后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增。与传统的PCR相比，具有扩增效率高，产物特异性高和经济简便特点，特别适合食品中病原微生物的快速测定。
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1多重PCR在食品中致病菌的检测
目前多重PCR的方法主要建立在食品中病原菌的检测，这方面的研究最多，建立的方法也最多。
1.1多重PCR检测同一致病菌
食品中的某些致病菌由于具有较多的血清型，很多DNA片段都是某些细菌所共有的，很难通过单一的PCR扩增某条片段进行确定。极易造成测定结果的假阳性，影响样品检测的有效性。采用多重PCR针对目的基因的多个DNA片段设计引物进行扩增，根据多条扩增结果来判断结果可以减少假阳性，提高测定结果的特异性。
产毒素大肠杆菌是引起腹泻的重要致病菌，通常分为三种类型：ETEC(产肠毒素大肠杆菌)、SLTEC(产志贺样毒素大肠杆菌)和NTEC(产坏死性大肠杆菌)。其中SLTEC可产生三种毒素类型(sLTl、SLT2和SLT2v)，主要血清型是0157：H7 L2J。杨小鹃等采用大肠杆菌0157：H7rfeE和fliC基因的保守序列设计两对引物，通过对包括猪肉鸡肉牛肉羊肉在内的65份样品进行检测，同时采用传统分离培养鉴定和测序验证进行方法对比，结果显示阳性样品与标准鉴定方法的一致性达到98%，显示出测定结果的特异性好。
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副溶血性弧菌主要存在于近海的海水、鱼类、贝类等海产品中的一种病原菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病等。在我国副溶血性弧菌引起的食物中毒在人数和起数上都处于第一位。李晓虹等根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计3对引物，采用PCR多重扩增，并对扩增结果特异性和标准菌株进行验证，结果采用多重PCR能够特异性的扩增副溶血性弧菌的450、269、500bp片段，而对其他种类菌没有特异性扩增。可在增菌8h后快速、简单、准确的检测出食品中副溶血性弧菌。 沙门氏菌(salmanella)是最常见食源性病原菌，所含细菌种类繁多。已发现超过2 500种以上的血清型。邵碧英等采用沙门氏菌属特异基因hut、hilA、invA、hns和hns 5个基因建立多重PCR检测方法，结果表明二重PCR检测灵敏度与单一PCR一致，三重PCR检测灵敏度有所下降。并未建立起同时检测4种基因的多重PCR方法。Soumet等根据沙门氏菌属随机克隆序列、伤寒沙门氏菌的fc基因和肠炎沙门氏菌的sefA基因设计了三对引物，应用多重PCR对1 078份家禽样品进行检测，敏感性可达95%，高于常规细菌学鉴定方法的92.5%。显示出方法建立的不稳定性和引物设计的重要性。
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1.2多重PCR检测不同致病菌
针对不同病原菌高度保守基因、特异性基因和毒素基因，设计相应的引物从而在同一反应体系中实现对多种病原菌的检测。可以大大缩短检测时间和降低成本。相对于检测同一致病菌，检测多种菌更有实际意义。由于食品中病原菌的数量较少，一般在检测前进行10～24h的增菌过程，可以显著提高样品检出率。陈伟等对金黄葡萄球菌(sA)的ntlc、单增李斯特菌(LM)的hly和蜡样芽孢杆菌(BC)的hemolysin基因，设计合成三对引物，结果显示方法检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同，结果稳定。具有推广应用价值。整个检测过程在16h完成，监测灵敏度可达1cfu/mL。李博等以金黄色葡萄球菌，志贺氏菌和沙门氏菌建立多重PCR获得相同的稳定结果。体现出在监测多重致病菌方面的优越性。杨平等对食品中主要存在的4种致病微生物沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，根据其主要特异性基因产物设计引物，建立起4种致病菌的多重PCR检测体系，体系中4种病原菌随机混合扩增均可成功，具有很强特异性，包括增菌时间10h即可检测完毕，在食品卫生检验中具有较强使用价值。焦豫良等对6种食品致病菌建立起的多重PCR灵敏度与单独PCR相同，所需时间更短，整个过程只需3-4h。显示出快速监测的优势。
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2多重PCR在食品中病毒的检测
病毒只能在活的宿主细胞内才可以生存，一般在食品中并不能繁殖和复制，但很多资料证明，多种病毒性疾病确实由食品传播的。如甲肝病毒，脊髓病毒，轮状病毒和诺沃克病毒等。由于能够引起食品中毒的病毒种类较少，而且血清型亦不是很多，所以采用多重PCR测定多种病毒意义不大，但在确定食品中是否存在某种病毒方面具有一定的优势，即用多重PCR检测某一病毒，2003年SARS期间，我国出口的食品和动植物产品被迫要求进行SARS病原检测要求。单一PCR必须进行两次PCR才能确定是否为SARS。陈文炳等采用人工合成的特异的SARS病毒DNA片段作为可以病毒添加到牛肉等食品中，然后采用公开发表合成的引物进行二重PCR扩增，并采用单重PCR对照分析，得到相同的灵敏度，获得和单重PCR相同的扩增片段。给食品中病毒的多重PCR检测提供了一个研究方向。
3多重PCR在食品中真菌污染的监测
, 百拇医药 真菌在谷物和其他食品中生长繁殖时会产生真菌毒素，真菌毒素会引起人畜严重的食物中毒，如何能够快速检测食品中真菌及其毒素对于食品卫生具有重大意义。对于真菌的检测，目前多采用化学色谱法、现代免疫学和毒理学试验等，大部分是针对其产生的毒素进行鉴定，而对于未开始产毒或产毒量小的真菌检测可能出现假阴性。多重PCR通过检测真菌的基因序列判断食品被真菌污染的程度，具有更高的检出率，检测食品更加安全。秦文彦等t13J根据黄曲霉毒素生化途径中的关键调控基因an、Romt—1和ver-1的序列以及真菌共有的5.8SrDNA的ITS序列分别设计ApaF/ApaR、OmtF/OmtR、VerF/VerR及ITSl/ITS4 4对引物，研究建立起产黄曲霉毒索真菌及在食品中的快速灵敏监测体系，扩增出的对应基因序列与基因库中对应的DNA序列同源性达99%以上，监测特异性较好，提示多重PCR可作为真菌及其毒素检测的潜在方法进行研究。
4存在的问题与展望
多重PCR作为一种快速、准确、灵敏的检测方法，但高灵敏往往伴随着稳定性低重复性差的问题，PCR技术本身对操作者和试剂要求较高，多重PCR的要求则更加苛刻。微量的外源DNA即可对结果产生巨大的影响，甚至产生假阳性，导致测定结果错误。同时多重PCR对引物的浓度，Mg2’离子的浓度、dNTPS浓度和扩增退火温度的要求更加严格，任何一种条件控制不当，都很容易造成非特异性扩增，甚至扩增失败。在建立方法时必须进行优化各个反应条件，使得测定结果更加稳定和清晰。
虽然存在上述问题，多重PCR作为一种快速检测食品中多重病原微生物的方法，具有无比的优越性，随着实验条件的逐渐优化，新的靶基因提取技术出现及各种技术的整合和发展，如将多重PCR和DHPLC，荧光探针定量技术和PCR—DGGE等技术相结合，形成一套完整的分子生物学检测体系。使检测方法具有更高的特异性，灵敏性和稳定性。, 百拇医药(安利伟 陈 蕊)