哮喘小鼠胸腺活化调节趋化因子及其受体的表达(2)
L dNTP mix 0.5μl，TARC(CCR4或GAPDH)上下游引物各0.5 μl，Taq酶(5 U/μd)0.2μl，去离子水补足至20μl。混匀离心15 s后置PCR仪中。扩增条件：94℃5 min；94℃1 min，退火温度30 s，72℃1 min，共35个循环；72℃10 min，共1个循环；4℃保存。退火温度TARC为54℃，CCR4为56℃，GAPDH为54℃或56℃。PCR产物观察：取PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用SmartView凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增带灰度值，以目的基因扩增带灰度值与内参照GAPDH扩增带灰度值之比，作为其mRNA表达的水平。
1.8统计学处理
全部数据经SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组比较采用成组设计资料的t检验。两变量的相关分析用Pearson直线相关分析法。以P
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的比较(x±s)
注：实验过程中因各种原因小鼠死亡或标本不合格，故鼠数与分组数不一致
2.3肺组织病理改变
对照组肺组织HE染色见支气管形态规则，上皮完整，支气管周围未见炎性细胞浸润；哮喘组支气管周围、肺间质和肺泡腔内可见炎性细胞浸润，支气管上皮断裂，细小支气管内可见黏液栓和炎性渗出物。
2.4 BALF和血清中TARC和IL-4浓度变化
哮喘组BALF和血清中TARC、IL-4浓度均高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(尸
注：实验过程中因各种原因小鼠死亡或标本不合格，故鼠数与分组数不一致
2.5肺组织TARC蛋白、TARC mRNA及CCR4mRNA表达的变化
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免疫组化显示TARC蛋白主要表达于支气管上皮细胞，对照组TARC蛋白呈阴性或弱阳性表达，哮喘组TARC蛋白呈棕黄色强阳性表达；哮喘组TARC mRNA及cCR4 mRNA表达的强度显著高于对照组。哮喘组TARC蛋白、TARC mRNA及CCR4 mRNA的表达量均显著高于对照组(P
2.6相关性分析
BALF和血清中TARC浓度与EOS绝对值均呈正相关(分别为r=0.867、r=0.765，P+T淋巴细胞明显增高，而在非变应性肺疾病如慢性阻塞性肺病气道中T淋巴细胞表达为CXCR3，而无CCR4的表达；Schuh等研究显示CCR4基因敲除(cCR4-/-)可明显降低变应性小鼠的气道高反应及EOS浸润，提示TARC及CCR4参与哮喘的发生发展。本实验结果表明，哮喘小鼠血清和BALF中TARC的浓度、肺组织TARC mRNA和CCR4mRNA表达均明显高于对照组，提示哮喘小鼠肺组织TARC及CCR4表达增高，并且其表达水平与IL-4浓度均呈显著正相关。CCR4是TARC高亲和力受体，高表达于Th2细胞，IL-4是Th2细胞分泌的主要细胞因子。提示TARC可能通过CCR4在气道炎症细胞募集和免疫应答中起重要作用。Borchers等体外研究发现TARC对小鼠EOS有较强的趋化性，提示TARC可能还参与对EOS的募集。在特应性皮炎患者，血清TARC水平还可作为其严重度及疗效评估的客观指标。本研究结果也显示BALF和血清中TARC浓度与BALF中EOS绝对值显著正相关，提示血清TARC浓度也可反映气道炎症细胞浸润的程度，并且在临床上有可能作为评估病情及疗效的指标。
, http://www.100md.com
Belpefio等在肺纤维化小鼠模型中发现TARC表达增高，并且用免疫组化法显示小鼠及人的支气管上皮细胞是产生TARC的主要来源细胞。本实验结果亦显示TARC主要表达于支气管上皮细胞，哮喘小鼠的表达明显增高。ELISA结果还显示对照组血清TARC浓度明显高于BALF浓度，而哮喘小鼠BALF中TARC浓度显著高于血清浓度，提示正常情况下支气管上皮细胞基本不分泌TARC，但哮喘发作时，支气管上皮细胞则分泌大量TARC。以上结果表明，支气管上皮细胞是TARC的主要来源细胞；哮喘发作时TARC分泌增多，促使，Th2细胞募集至炎症部位，引起IL-4分泌增加，而IL-4又促进TARC的分泌，从而启动和扩大气道炎症的发生发展。因此通过趋化因子及其受体来抑制Th2细胞在肺内炎症部位的募集已成为一种新的研究热点。相信随着进一步对趋化因子的深入研究，以TARC及CCR4为靶目标的针对性措施有望成为气道炎症性疾病一种新的治疗途径。
[ 上 页 ], http://www.100md.com(李昌崇)
1.8统计学处理
全部数据经SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组比较采用成组设计资料的t检验。两变量的相关分析用Pearson直线相关分析法。以P
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的比较(x±s)
注：实验过程中因各种原因小鼠死亡或标本不合格，故鼠数与分组数不一致
2.3肺组织病理改变
对照组肺组织HE染色见支气管形态规则，上皮完整，支气管周围未见炎性细胞浸润；哮喘组支气管周围、肺间质和肺泡腔内可见炎性细胞浸润，支气管上皮断裂，细小支气管内可见黏液栓和炎性渗出物。
2.4 BALF和血清中TARC和IL-4浓度变化
哮喘组BALF和血清中TARC、IL-4浓度均高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(尸
注：实验过程中因各种原因小鼠死亡或标本不合格，故鼠数与分组数不一致
2.5肺组织TARC蛋白、TARC mRNA及CCR4mRNA表达的变化
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免疫组化显示TARC蛋白主要表达于支气管上皮细胞，对照组TARC蛋白呈阴性或弱阳性表达，哮喘组TARC蛋白呈棕黄色强阳性表达；哮喘组TARC mRNA及cCR4 mRNA表达的强度显著高于对照组。哮喘组TARC蛋白、TARC mRNA及CCR4 mRNA的表达量均显著高于对照组(P
2.6相关性分析
BALF和血清中TARC浓度与EOS绝对值均呈正相关(分别为r=0.867、r=0.765，P+T淋巴细胞明显增高，而在非变应性肺疾病如慢性阻塞性肺病气道中T淋巴细胞表达为CXCR3，而无CCR4的表达；Schuh等研究显示CCR4基因敲除(cCR4-/-)可明显降低变应性小鼠的气道高反应及EOS浸润，提示TARC及CCR4参与哮喘的发生发展。本实验结果表明，哮喘小鼠血清和BALF中TARC的浓度、肺组织TARC mRNA和CCR4mRNA表达均明显高于对照组，提示哮喘小鼠肺组织TARC及CCR4表达增高，并且其表达水平与IL-4浓度均呈显著正相关。CCR4是TARC高亲和力受体，高表达于Th2细胞，IL-4是Th2细胞分泌的主要细胞因子。提示TARC可能通过CCR4在气道炎症细胞募集和免疫应答中起重要作用。Borchers等体外研究发现TARC对小鼠EOS有较强的趋化性，提示TARC可能还参与对EOS的募集。在特应性皮炎患者，血清TARC水平还可作为其严重度及疗效评估的客观指标。本研究结果也显示BALF和血清中TARC浓度与BALF中EOS绝对值显著正相关，提示血清TARC浓度也可反映气道炎症细胞浸润的程度，并且在临床上有可能作为评估病情及疗效的指标。
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Belpefio等在肺纤维化小鼠模型中发现TARC表达增高，并且用免疫组化法显示小鼠及人的支气管上皮细胞是产生TARC的主要来源细胞。本实验结果亦显示TARC主要表达于支气管上皮细胞，哮喘小鼠的表达明显增高。ELISA结果还显示对照组血清TARC浓度明显高于BALF浓度，而哮喘小鼠BALF中TARC浓度显著高于血清浓度，提示正常情况下支气管上皮细胞基本不分泌TARC，但哮喘发作时，支气管上皮细胞则分泌大量TARC。以上结果表明，支气管上皮细胞是TARC的主要来源细胞；哮喘发作时TARC分泌增多，促使，Th2细胞募集至炎症部位，引起IL-4分泌增加，而IL-4又促进TARC的分泌，从而启动和扩大气道炎症的发生发展。因此通过趋化因子及其受体来抑制Th2细胞在肺内炎症部位的募集已成为一种新的研究热点。相信随着进一步对趋化因子的深入研究，以TARC及CCR4为靶目标的针对性措施有望成为气道炎症性疾病一种新的治疗途径。
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