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编号:11039301
阻断胰腺癌细胞膜ｈＥＮＴｓ对氟尿嘧啶细胞毒性的影响
http://www.100md.com 2006年6月1日 高毅明 刘胜利
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    参见附件(322KB，5页)。

     [摘要]

    目的 研究胰腺癌细胞株中核苷载体(NTs)的表达，以及应用潘生丁(dipyridamole，DP)阻断平衡型核苷转运载体(hENTs)后，5氟尿嘧啶(5Fluorouraci，5FU)对胰腺癌细胞株毒性作用的影响。方法 选择胰腺癌细胞株Panc1、Sw1990和Aspc1进行实验。RTPCR法检测细胞株hENT1、hENT2、hCNT1、hCNT2和hCNT3的mRNA表达。根据DP浓度将各细胞株分为4个实验组，即DP空白组，DP浓度为5μmol·L-1组、10μmol·L-1组和40μmol·L-1组,每组细胞分别在含有一定浓度(0～2×108 ng·L-1)的5FU的培养液中培养48h。MTT法检测每组3种细胞株的增殖，并计算各组5FU的半数抑制浓度(IC50)。结果 hENT1的mRNA在Panc1和Sw1990中表达较在Aspc1中高(P< 005)，hENT2在Aspc1中未见表达；hCNTs在3种细胞株中均有表达,且无明显差异。DP本身对3种细胞株无毒性作用，而5FU与其联合后能明显提高5FU对高表达hENTs细胞(Panc1和Sw1990)的毒性作用；在DP 10μmol·L-1时，对Panc1细胞的毒性作用增强7倍(P< 001)，对Sw1990细胞增强10倍(P< 001)。而在hENT1低表达、hENT2未见表达的细胞(Aspc1)中，DP对5FU的毒性作用没有影响。结论 在胰腺癌细胞株中，DP阻断细胞膜上hENTs后能显著增强5FU的作用效果，提示在临床上可能需要依据hENTs的表达情况来选择联合应用hENTs阻断剂增强核苷类抗癌药物作用。

     [关键词] 细胞毒性；胰腺癌细胞株；核苷转运载体；5氟尿嘧啶；潘生丁

    [中图分类号] R33；R736.7

    The effect of human equilibrative nucleoside transport(hENTs)in pancreatic cancer cell membrane on the cytotoxicity of 5fluorouracil

    GAO Yiming，LIU Shengli(Department of Hepatopancreatobiliary Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing 210009，China)

    Abstract:Objective To investigate subtype expressions of nucleoside transporters in pancreatic cancer cell lines，and the effects of dipyridamole (DP),one of the hENTs blockers，on 5 Fluorouracil (5FU) cytotoxicity to the cell lines. Methods Three pancreatic cancer cell lines(Panc1,Sw 1990,Aspc1) were chosen to detect the mRNA expressions of hENT1，hENT2，hCNT1，hCNT2 and hCNT3 with RTPCR. According to the DP concentration in the study，the cell lines were divided into four groups，the zero DP concentration group，5 μmol·L-1 group，10 μmol·L-1group and 40 μmol·L-1group. The cells in each group were incubated in the medium with a serial concentrations of 5FU from 0 to 2×108ng L-1for 48 h. Then the cell proliferation in each group was measured with MTT assay and the IC50were evaluated. Results The expression of hENT1 was higher in Panc1 and Sw1990 than that in Aspc1(P< 005)，while the hENT2 was not to be detected in Aspc1. All the three cell lines expressed hCNTs but no difference was found. DP itself did not present any toxic effects on the three cell lines. However，combined with 5FU,the cytotoxicity to the cells with high expressions of hENTs (Panc1 and Sw1990) was significantly increased，7 times increased in Panc1 and 10 times increased in Sw1990 in 10 μmol·L-1of DP (P<001). In contrast，in the Aspc1 cells with low hENT1 expression and no hENT2 expression,the 5FU cytotoxicity was not influenced by DP. Conclusions DP can significantly enhance the 5FU cytotoxic effect on the pancreatic cancer cell by blocking hENTs transporters on the cell membrane. It is implicated that the hENTs expression may be the clue for the choice of hENTs blockers with nucleoside anticancer drugs in clinic.

    Key words:cytotoxicity；pancreatic cancer cell line；nucleoside transporter；5fluorouraci；dipyridamole

    提高肿瘤细胞内的药物浓度可增强化疗效果。核苷类抗癌药是通过细胞膜核苷转运载体(nucleoside transporters，NTs)进入肿瘤细胞的,核苷载体在细胞膜上的表达情况，将影响核苷类药物的作用效果。迄今发现两类NTs,即平衡型核苷载体hENTs(human equilibrative nucleoside transporters,hENTs)和Na+离子依赖的主动转运载体hCNTs(human concentrative nucleoside transporters,hCNTs)。由于hENTs顺底物浓度差转运核苷类药物，为双向通道，因此，推测hENTs可能介导了核苷药物分子向细胞外返流，使细胞内药物难以达有效浓度。我们以前的研究[1]已经证实，用潘生丁(dipyridamole，DP)阻断 hENTs后可显著提高5氟尿嘧啶(5Fluorouraci，5FU)在胰腺癌Panc1细胞内的浓度。作者进一步研究了3种胰腺癌细胞株中核苷载体的表达，以及阻断hENTs后5FU对3种细胞株毒性改变情况，探讨核苷载体与5FU发挥作用之间的关系。

     1 材料与方法

    1.1 细胞培养与药物准备

    胰腺癌细胞株Panc1和Aspc1由东南大学基础医学院病理学与病理生理学系提供，Sw1990由上海市第一人民医院赠送。Panc1和Sw1990用DMEM培养基，Aspc1用RPMI1640培养基。培养基中含10%灭活小牛血清、青霉素10万U·L-1、链霉素100mg·L-1。细胞在湿度为95%、温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱内培养。

    5FU(批号：0597)、DP(批号： H4159)、二甲基亚砜(DMSO,批号：D5879)等标准品均由美国Sigma公司生产，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司。TRIzol试剂(批号：15596026)购自Invitrogen公司，RTPCR试剂盒(批号：DRR019A)为TaKaRa公司产品。

    5FU用培养液配成储备液(250g·L-1)，由于DP微溶于水，故用培养液和少许DMSO溶解(培养液中DMSO浓度不超过01%)，配成储备液浓度为400μmol·L-1,pH调至72，过滤，4℃保存备用。

    1.2 RTPCR半定量检测细胞株核苷载体mRNA表达

    胰腺癌细胞株总RNA应用TRIzol试剂一步法提取(按Invitrogen公司产品说明进行)，应用凝胶电泳检测RNA的完整性(28s、18s、5s亚基条带清晰，28s与18s荧光强度之比为2∶1，无降解杂带)。测定RNA浓度并调整各细胞株RNA浓度基本一致。根据基因库编码合成引物，其中hENT1引物由上海生物工程有限公司设计,其余核苷载体引物与GarciaManteiga[2]的设计一致，并由上海生物工程有限公司合成。hENT1核苷载体及βactin的引物序列：hENT1(上游5′AGC AGG CAA AGA GGA ATC TGG AGT3′,下游5′GAA GGC AAA GGC AGC CAT GAA GAA3′)；βactin(上游5′CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC3′,下游5′ CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC T3′)。各引物扩增后产物理论长度为：hENT1436bp，hENT2430bp，hCNT1800bp，hCNT2610bp，hCNT3480bp，βactin270bp。

    以1μg各个细胞株RNA为模板，按TaKaRa公司试剂盒所提供的方法进行RTPCR，用βactin作为内参。RTPCR共同反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min。仅退火温度不一，其中hENT1与hENT2为55℃,hCNT1与hCNT2为50℃，hCNT3为52℃。反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离(电压100V，时间40min)，ImageMaster VDS扫描分析仪测定各显色带灰度，并计算其与内参的相对比值。上述实验重复3次。

    1.3 MTT法检测不同浓度DP联合5FU的细胞毒性

    将进入对数生长期的细胞接种于两张96孔板中，其中Panc1为4000个·孔-1，Sw1990和Aspc1为5000个·孔-1，待细胞贴壁后进行细胞毒性实验。

    本实验5FU浓度序列为0、1.28×104、6.4×104、3.2×105、1.6×106、8×106、4×107、2×108ng·L-1。根据DP浓度分为4组，即DP空白组，DP浓度为5、10和40μmol·L-1组。为减除背景，每组均另设空白孔和对照孔。每个5FU浓度设3个复孔。按上述分组分别加入含相应浓度药物的培养液培养48h，用MTT法[3]测定细胞生存率，酶标仪570nm处测吸光度(A)值。细胞生存率=(A实验孔-A空白对照)/(A正常对照-A空白对照)。上述实验均重复3次。绘制细胞生长曲线，5FU的半数抑制浓度(IC50)用GraphPad Prism 4 Demo软件(Version 403)计算。

    1.4 统计分析

    各组数据以x-±s表示，组间差异采用单因素方差分析(SPSS 11.5软件)，以P<005为有显著性差异。

     2 结果

    2.1 胰腺癌细胞株核苷载体的表达水平

    见图1、表1。

    图1 半定量RTPCR检测胰腺癌细胞株hENT1，hENT2，hCNT1，hCNT2，hCNT3的mRNA表达，以βactin为内参(略)

    表1 3种细胞株中各核苷载体与内参βactin的灰度比值(略)

    表1显示，依各核苷载体亚型表达量高低，3个细胞株中Panc1细胞hENT1>hCNT1>hENT2>hCNT2>hCNT3，Sw1990细胞 hENT1>hCNT1>hENT2>hCNT2>hCNT3，Aspc1细胞 hCNT1>hCNT3>hENT1>hCNT2>hENT2。

    同时，hENT1在Panc1中表达量和在Sw1990中表达量相近，差异无统计学意义(P>005)。hENT1在Panc1中和Sw1990中的表达量均较Aspc1中表达量高，分别为Aspc1中的2.3和2.0倍(P< 005)；hENT2在Panc1和Sw1990有表达，两者之间差异无统计学意义(P>005)，但Aspc1中未见表达。hCNT1在Panc1表达较Sw1990和Aspc1高(P<005)，表达量分别是这两种细胞株的1.4倍和1.5倍。hCNT1在Sw1990和Aspc1中的表达差异不明显(P>005)。hCNT2在3种细胞株中的表达基本相似(P>005)。hCNT3在Aspc1中表达较高，分别为Panc1与Sw1990的1.6和1.3倍(P< 005)，而在Panc1与Sw1990的表达无显著差异(P>005)。

    上述结果表明，在Panc1和Sw1990中，hENT1表达量高，hENT2有表达；而在Aspc1中，hENT1低表达，hENT2未见表达；hCNT3在Aspc1中高表达。

    2.2 DP对5FU细胞毒性的增强作用

    见表2。

    表2 不同浓度DP下，3种胰腺癌细胞株5FU的IC50(略)

    实验中发现，DP单独使用对3种细胞株的增殖影响不大，不同浓度DP单独使用对细胞生存率改变的差异无显著意义(P>005)(数据未给出)。

    相比之下，DP与5FU联合应用，在Panc1和Sw1990中却明显增加了5FU的毒性。比较不同浓度DP与5FU联合应用对这两种细胞所产生的细胞毒性时发现,随着DP浓度增加，5FU的IC50逐渐降低。DP空白组、DP 5μmol·L-1组和DP 10μmol·L-1组的5FU的IC50逐渐下降，三者差异有显著性(P< 001)。Panc1细胞中，DP 5μmol·L-1组和DP 10μmol·L-1组的5FU的IC50分别为DP空白组的2/5和1/7；Sw1990细胞中，DP 5μmol·L-1组和DP 10μmol·L-1组的5FU的IC50分别为DP空白组的2/5和1/10。但这两种细胞的10μmol·L-1和40μmol·L-1两组之间5FU的IC50差异却无显著意义(P>005)。这说明DP浓度在0～10μmol·L-1范围内可明显增强5FU对Panc1和Sw1990的毒性作用，DP浓度继续升高对5FU毒性的增强作用不再增加，可能呈现饱和现象。

    然而，DP对Aspc1细胞增强5FU疗效的作用不明显，Aspc1细胞各DP浓度组间5FU的IC50并非随着DP浓度增加而降低(P>005)，组间差异无显著性。

    2.3 核苷载体的表达与5FU的毒性

    DP对5FU毒性的增强作用与肿瘤细胞hENTs表达水平呈平行关系。hENT1在Panc1和Sw1990中高表达，亦见hENT2表达，DP在这两株细胞对5FU毒性的增强作用明显。hENT1在Aspc1中低表达，hENT2无表达，DP在该株细胞对5FU毒性的增强作用不明显。

     3 讨论

    提高细胞内有效药物浓度是增强化疗效果的途径之一。在迄今发现的两类载体中，hENTs在核苷的跨膜转运中起着最重要的作用，其中又以hENT1对核苷转运作用最为突出，转运速度(Vmax)较快，通量最大[4]。hENTs顺浓度梯度转运核苷，系被动转运过程，因此，hENTs对核苷的跨膜转运是双向的。核苷类化疗药物如5FU也是借助细胞膜核苷载体的转运进入肿瘤细胞的[5]，这可能为5FU向细胞内转运的同时也提供了向外返流通道，使肿瘤细胞内5FU难以达到有效浓度。因此，细胞膜hENTs表达量的多少可能影响5FU的细胞毒性作用和临床疗效。然而在本实验中，并未显示这样的结果。虽然3个细胞株中hENTs表达差异较大，如Aspc1细胞中hENT1表达量较低，且hENT2未见表达,但其5FU的IC50却未见比其他细胞株显著增高，即未见hENT1低表达和hENT2未见表达而出现对5FU敏感或耐药现象。在单独5FU的作用下，5FU进出细胞主要以药物的浓度梯度为原动力，直至5FU在细胞内外平衡。因此，本实验细胞中在5FU持续等浓度培养条件下，即使hENTs表达差异较大，也难以显现细胞固有耐药的差异。

    阻断hENTs将可能在阻断5FU向细胞内转运的同时阻断向细胞外返流。此时若仍有其他核苷载体继续将5FU向细胞内单向转运，将可能大大提高细胞内5FU的有效浓度，从而增强5FU的抗癌效果。目前已发现的另一类核苷载体hCNTs为单向向细胞内主动转运的核苷载体，能逆浓度差将核苷向细胞内转运[5]。藉此，阻断hENTs可能不会影响hCNTs对5FU的转运。

    本研究结果显示，在hENTs高表达的Panc1和Sw1990细胞株5FU的细胞毒性增加，在DP 10μmol·L-1组，5FU的IC50分别为DP空白组的1/7和1/10，而在hENT1表达量低、无hENT2表达的Aspc1中，5FU的细胞毒性增加并不明显。这一结果提示，本研究DP对hENTs起到了阻断作用，阻断hENTs能增强核苷类化疗药5FU的抗癌效果，DP对5FU细胞毒性增强作用依赖于肿瘤细胞膜hENTs有无表达和表达量的多少。

    我们以前的研究[1]结果显示，用DP阻断hENTs后可明显增加5FU在肿瘤细胞内药物浓度。阻断hENTs即阻断了5FU向细胞外返流，而此时5FU通过 hCNTs继续向细胞内转运。本研究结果进一步证实了阻断hENTs后5FU在肿瘤细胞内浓度增加，大大增强了5FU的细胞毒性。

    比较5FU的抗癌效果被增强的细胞株(Panc1和Sw1990)的IC50发现，不同DP浓度组5FU的IC50在5μmol·L-1组、10μmol·L-1组逐渐下降(P< 001),之后，即使PD浓度增加至40μmol·L-1，5FU的IC50基本不再下降。此结果与Achiwa等[6]所报道的一致，即DP浓度在10 μmol·L-1时可将hENTs完全阻断，DP与hENTs结合存在饱和现象。

    本研究证实，阻断hENTs可能成为增强核苷类抗癌效果的有效途径之一。DP系作用于心血管和抗血小板凝集的常用药物，在全身用药时DP剂量范围在血浆和组织中浓度不可能达到 10μmol·L-1[7]。因此，DP对5FU的增强作用难以在临床应用中实现。然而，进一步研究DP对hENTs的作用部位和关键基团的特性，将对研发高效、低毒的hENTs阻断剂有重要的指导意义。肿瘤细胞膜hENTs的表达水平也可能预示着hENTs阻断剂能否增强核苷类抗癌药物对该种肿瘤的效果。

     [参考文献]

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    (东南大学附属中大医院肝胆胰外科,江苏 南京 210009)

    [基金项目] 东南大学913/事业基金资助项目(929001327)

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