乌饭树树叶及其提取物对视网膜光损伤的保护作用
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摘要：目的 研究乌饭树树叶及其提取物对视网膜免受光损伤的保护功能。方法 将20只新西兰白兔分成4组：正常对照组和模型对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。正常对照组动物自由摄取饲料，自由饮水；模型对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组动物除自由摄取饲料，自由饮水外，每天分别喂乌饭树新鲜树叶[50g/(kg·d)]、乌饭树陈旧树叶[50g/(kg·d)] 和乌饭树树叶提取物[50mg/(kg.d)],连续4周。并且进行强光刺激，同时利用视网膜电图(ERG)进行视网膜分析，最后处死白兔测定视网膜中丙二醛(MDA) 的含量和总超氧化物岐化酶(TSOD)的活力。结果 ERG测定结果发现，对照组B波的潜伏期时间延长而振幅降低，模型组白兔ERG的变化趋势正好相反。同时模型组视网膜中的MDA含量要低于对照组(P<0.01)，而SOD含量则高于对照组(P<0.01)。结论 服用乌饭树树叶及其提取物对眼睛视网膜具有明显的保护作用。
关键词：乌饭树；提取物；视网膜；光损伤
The protective effect of Vaccinium Bracteatum Thunb leaves and the extract against light injury of retina
Wang Li, Zhang Xuetong, Yao Huiyuan
(School of Food Science and Technology, Southern Yangtze University, Wuxi 214036;Department of Ophthalmology of the Wuxi No.4 Peoples Hospital, Wuxi 214036, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of the extract of Vaccinium Bracteatum Thunb (VBT) leaves against light injury of retina. Methods 20 Newzealand rabbits were divided into 4 groups: the normal control group, modelⅠgroup, modelⅡ group, and model Ⅲ group. The normal control group ate and drank freely. modelⅠgroup ate and drank freely but took in 50g/(kg·d) fresh VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅱgroup ate and drank freely, but took in 50g/(kg·d) old VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅲ group ate freely, but took in 50mg/(kg·d) extract of VBT leaves(resolved in water) daily for 4 weeks. All rabbits were exposed to strong light, meanwhile, the retinas were analyzed by electroretinogram (ERG) every week. Finally, all the rabbits were killed and the content of MDA and SOD in the retina were detected. Results In the control group, the latency time of the B wave increased and the amplitude of the B wave shortened, while in the model Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ groups, the changes of B wave just opposite. The content of MDA in the model Ⅰ,Ⅱ, and Ⅲ groups was lower than that in the control group(P<0.01), but the content of SOD in the model Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ groups was higher than that in the control group(P<0.01). Conclusion The leaves of VBT and the extract can protect the retina against light injury.
KEY WORDS: Vaccinium Bracteatum Thunb(VBT); extract; retina; light injury
乌饭树是杜鹃花科的一种植物，我国南北各地均产，很多中药类书籍中都记载其对人体具有保健作用[12]。国外对乌饭树同种属植物的果实进行研究发现，其对多种眼科疾病均有很好的治疗效果，目前很多国家都已经把乌饭树紫黑浆果中提取出的色素类物质用于眼科医疗领域。意大利、法国、西班牙、韩国、美国以及新西兰等国家已经将其应用于夜盲症、毛细管脆弱、脑血管障碍、胃溃疡的治疗[34]。本研究采用强光刺激损伤白兔视网膜，同时喂食乌饭树树叶或其提取物，利用视网膜电图技术(electroretinogram, ERG)对白兔视网膜进行研究，然后对视网膜进行丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)含量分析，最后对其保护机理进行了初步的探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 新西兰大白兔20只，购自江南实验动物场，体重(2.5±0.5)kg。
1.1.2 药品与试剂 乌饭树树叶，购自于江苏溧阳；乌饭树树叶提取物，实验室自制；美多丽眼液，参天制药株氏会社(日)；倍诺喜眼液，参天制药株氏会社(日)；总蛋白含量测试盒，购自于南京建成生物研究所； MDA含量测定试剂盒，购自于南京建成生物研究所； SOD活力测定试剂盒，购自于南京建成生物研究所；PBS(磷酸盐缓冲液)：800mL蒸馏水中溶解8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用盐酸调节pH至7.4，加水定容至1L，在1.034×105Pa高压下杀菌20min，保存于室温。
1.1.3 主要仪器 全视野闪光刺激器，重庆医用电子仪器厂；视觉电生理检查与诊断系统VETSⅢB，重庆医用电子仪器厂。
1.2 方法 20只新西兰大白兔适应性喂养1周，自由摄取饲料，自由饮水。然后用1000W强光照射，刺激眼睛视网膜产生光损伤，同时按照不同的组别进行喂养食物，每周进行ERG的测量。具体分组如下：正常对照组：自由摄取饲料，自由饮水。模型对照Ⅰ组：自由摄取饲料，自由饮水，另外每天喂乌饭树新鲜树叶，按照50g/(kg·d)剂量喂养，连续4周。模型对照Ⅱ组：自由摄取资料，自由饮水，另外每天喂乌饭树陈树叶，按照50g/(kg·d)剂量喂养，连续4周。模型对照Ⅲ组：自由摄取饲料，另外每天喂乌饭树树叶提取物(溶解于饮水中)，按照50mg/(kg·d)剂量喂养，连续4周。
1.2.1 ERG的测量 记录电极为角膜式接触电极，参考电极和接地电极为普通电极。预先用剪刀剪去白兔额部毛，再用剃须刀刮干净。进行ERG测量操作前先用美多丽眼液对白兔进行扩瞳，暗适应30min，眼角膜用倍诺喜进行麻醉。分别利用蓝光、白光和红光对白兔视网膜进行刺激(在白光刺激后明适应30min再进行红光刺激测定)。记录电极置于兔子眼角膜表面，参考电极置于靠近兔子额部，用胶布固定，接地电极置于兔子耳朵上，用胶布固定。测量时，兔子头部置于刺激球中央，对单只眼睛视网膜进行刺激。刺激条件：高频85Hz，低频0.1Hz，刺激光亮度1.5Log，单次刺激。记录仪进行同步记录，经过仪器分析得到B波的延滞时间(以ms为单位)和振幅(以μV为单位)，进行分析。
1.2.2 视网膜匀浆的制备 于实验30d后将白兔处死，摘除眼球，仔细去除眼内容物，剥离视网膜，置于冰冷的玻璃匀浆器中，冰浴下碾磨5min，制成匀浆，10000r/min高速离心15min，取上清液待用。
1.2.3 总蛋白含量的测定 蛋白质上的氨基(-NH3+)与考马斯亮兰染料上的阴离子结合，能够使溶液从棕红色变为蓝色，通过测定吸光度值可以计算出其中的蛋白质含量。取组织匀浆50μL，按照试剂盒配制试剂，并且进行测量。
1.2.4 MDA的测定 过氧化脂质的分解产物-MDA与硫代巴比妥酸作用后形成红色物质，利用分光光度计测定吸光度，可以计算出其中的丙二醛含量。按照试剂盒配制试剂，并且进行测量。
1.2.5 总超氧化物岐化酶(TSOD)活力的测定 通过黄嘌呤以及黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基[O-2·]，氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，当样品体系中含有SOD时，则对[O-2·]有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值要低于对照管的吸光度，通过计算可以得出视网膜中SOD的活力。按照试剂盒配制试剂并且测量。
2 结果
2.1 ERG测定结果 ERG分别由PⅠ、PⅡ和PⅢ三个导程构成，B波是ERG中属于其中的PⅡ导程部分，紧随A波后的一个正相波。它起源于光感受器与神经节细胞之间的神经通路中的一种光兴奋活动，可能来自双极细胞或Müller细胞。它反映视网膜内核层区域细胞的电活动，并且反应非常迅速，受外界因素的影响较为明显，如缺氧、温度变化以及不同的光刺激等，因此B波作为评价视网膜功能可靠而灵敏的客观指标之一，近年来越来越受到重视。在本研究中测定白兔在受强光刺激后暗视ERG、暗反应最大波和明视ERG中B波的变化。在实验中采用三种光(蓝光、白光、红光)对白兔视网膜进行刺激，其中蓝光测定值代表的是暗视ERG，白光测定值代表的是暗反应最大波，而红光测定值代表的是明视ERG。具体结果见表1-3。
2.2 白兔眼睛视网膜抗氧化指标的检测结果 实验30d后，将白兔的视网膜取出，进行适当的处理，测定其中的MDA和TSOD含量，前者可以反映视网膜脂质过氧化的程度，而后者则反映其中抗氧化酶体系活力的变化。具体结果见表4。
表1 白兔暗适应ERG——B波的潜伏期及振幅的变化(略)
Table 1 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the dark adaptation ERG of the rabbits
Model Ⅰ：fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group
表2 白兔暗反应最大波——B波的潜伏期及振幅的变化(略)
Table 2 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the scotopic threshold response of the rabbits
Model Ⅰ：fed with fresh leaves ; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ:fed with the extracts from leaves
*P<0.05, **P<0.01 vs. contro group
表3 白兔明视ERG——B波的潜伏期及振幅的变化(略)
Table 3 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the photopic ERG of the rabbits
Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group
表4 不同实验组别白兔眼睛视网膜抗氧化酶体系的检测结果(略)
Table 4 The contents of the MDA and SOD in the retina of different groups
Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group
3 讨论
从表1-3中可以看出，随着实验时间的延长，对照组B波的潜伏期逐渐延长，而模型组(Ⅰ-Ⅲ)则都在一定程度上有所降低，而B波振幅的变化趋势正好相反。
由于视杆细胞对蓝光敏感，因此暗视蓝光ERG主要反映的是眼睛视网膜中视杆细胞的变化。从表1中的变化趋势可以看出，乌饭树树叶和其提取物对视杆细胞具有明显的改善作用。
视锥细胞对红光敏感，所以明视ERG主要反映的是眼睛视网膜中视锥细胞的变化。从表2中的变化趋势可以看出，乌饭树树叶和其提取物对视锥细胞同样具有明显的改善作用。
暗反应最大波是视网膜明视系统和暗视系统的混合反映，其中的B波是视杆细胞兴奋后产生的电位变化，可能起源于Müller细胞或双极细胞。其反映视网膜内核层区域细胞的电活动，取决于视网膜内信号传递过程的完整性[5]。从表3可以看出，乌饭树树叶和其提取物对于视网膜的视觉系统有很强的维护作用。
从表1-3还可以看出新鲜树叶和陈树叶对于视网膜的保护作用基本一致，说明在新鲜树叶储藏期间没有功能性物质的损失，或者是损失很少，这样也就可以为原料的储藏提供了一些依据。
MDA是脂质过氧化的产物，通常被用来衡量脂质过氧化的程度。视网膜的视细胞外节主要是盘膜结构，内含丰富的长链多不饱和脂肪酸，在受到光的作用后，易从位于两个双键之间的亚甲基上脱去氢原子，形成质子自由基，然后发生双键和未配对电子位置的转移，形成较稳定的共轭双键，再与氧反应，形成质子自由基和质子过氧化物。这些自由基再攻击其他不饱和脂肪酸，引起连锁反应，从而使盘膜以及线粒体膜和内质网膜的脂类受到损害。
环境光的损伤被认为是一种光化学损伤。感光器外段富含长链不饱和脂肪酸，内段富含线粒体，对氧的需求大，当光子被视紫红质吸收后可产生一系列的自由基，它们与感光器和视网膜色素上皮(RPE)中的不饱和脂肪酸发生反应，发生脂质过氧化反应，引起眼睛组织破坏。从表4中可以看出，对照组的白兔眼睛视网膜中MDA的量大大超过正常白兔眼睛视网膜中的量[6]，说明实验中的强光刺激对白兔眼睛有了很严重的损伤；而模型组Ⅰ-Ⅲ的白兔视网膜中的MDA含量接近于正常白兔眼睛视网膜中的量，说明白兔食用乌饭树树叶或树叶提取物后，视网膜内部的脂质过氧化得到了有效的抑制。其主要原因应该是由于乌饭树树叶含有丰富的黄酮类物质[4]，黄酮类物质具有很强的清除自由基能力，而视网膜光化学损伤的主要发病机制是脂质体过氧化[7]，所以在实验中服用乌饭树树叶或其提取物的白兔视网膜受到很好的保护。
视细胞中含有大量的线粒体，其中的呼吸链在进行电子传递时可产生自由基，如辅酶Q是醌类化合物，通过氧化还原可生成半醌自由基。视细胞中的视黄醛或视黄醇受可见光照时也可产生自由基。许多研究表明，视网膜的光损伤是光照激发产生自由基，引起组织发生过氧化的结果。在正常情况下，机体内自由基的产生与清除过程处于动态平衡，在遭受各种外界因素的影响时，平衡被破坏，机体受损。视网膜本身具有一定的抗氧化能力，在一定程度上可以预防光化学损伤。它各层均存在清除自由基的天然保护系统，包括抗过氧化物酶和自然抗氧化剂[8]，它们可以通过各种化学反应而终止自由基链反应，达到清除有害自由基，防止组织破坏的目的。从表4可以看出，对照组白兔眼睛视网膜中SOD要远低于其他3个模型组，说明乌饭树树叶以及其提取物能够有效地保护视网膜中的SOD，使其能够保持活性。视网膜抗氧化能力下降时，容易受到光的损伤，反之在受到光的刺激损伤后，视网膜中的抗氧化酶体系必定发生变化。从表4可以看出，对照组的白兔眼睛视网膜中SOD的量大大低于正常白兔眼睛视网膜中的量[6]。有实验表明，光照可以使细胞内SOD水平下降[9]，而SOD是生物体内自由基清除剂之一，可以促进超氧化物阴离子自由基的岐化反应。在本研究中可能的机理是乌饭树树叶及其提取物能够将超氧阴离子自由基[O-2·]转变为O2和H2O，清除其毒性作用，减轻和防止过氧化，从而达到保护视网膜的作用。同时，从表4可以得出结论，新鲜树叶和陈树叶可以达到基本一致的效果。
综上所述，乌饭树是一种很丰富的天然资源，其功能在很多中药典籍中都有记载，但是目前的应用不是很广泛，原因是人们对它的功能和具体的作用机理不了解。本研究发现乌饭树树叶或其提取物能够有效地预防保护视网膜免受光损伤，服用50g/(kg·d)的乌饭树树叶或者50mg/(kg·d)的提取物，可以起到明显的效果。
参考文献：
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(编辑 卓选鹏)
(江南大学食品学院，江苏无锡 214036；无锡第四人民医院眼科，江苏无锡 214036)
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