人类神经生长因子β基因重组腺病毒载体的构建
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摘要 目的：为研究人神经生长因子β(hNGFβ)基因对慢性神经病理性痛的治疗作用，构建人类神经生长因子 6基因重组腺病毒载体。方法：将hNGFp外源性核酸片段插入到pBluescnptⅡSK(+)的XmaI与XbaI位点，构建成pBluescriptⅡSK(+)—hNGFβ，再将其与腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV经Kpn I和NotI双酶切后，构建成转移质粒pShuttle—CMV—hNGFβ，将该转移质粒经PmeI酶切后，转化含腺病毒骨架质粒pAdZasy-1的感受态菌DJ5183，重组为pAdEasy-1—hNGFβ，经PCR鉴定后，LipoVec介导pAdEasy-1—hNGFβ转染AD293细胞，将透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定。并进行自动测序鉴定。结果：线性化的pShuttle—CMV— hNGFβ转化含pAdEasy-1的感受态菌BJ5183，24 h后获得了30%阳性重组质粒，经酶切得到一个大于20 kL的大片段和一个4.5 kb的特征性条带，PCR扩增出731 bp片段。pAdeasy-1—hNGFβ经PacI酶切线性化后，转染 Ad293细胞包装成表达hNGFβ的重组腺病毒。260 nm处吸光值测病毒滴度为2.24X10112OPU·L-1。重组Ad— hNGFβ腺病毒质粒经上海基康生物技术有限公司自动测序鉴定为目的基因。结论：应用细菌内同源重组能快速构建Ad—hNGFβ，为hNGFβ基因在神经病理性痛中的应用奠定了基础。
关键词 同源重组；腺病毒；基因；人类神经生长因子β;AD293细胞
中图分类号 Q784 文献标识码 A 文章编号 1671—S852(2005)04—0431—04
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