睾丸生精细胞凋亡的基因调控(2)
2Fas/FasL系统
Fas是一个有319个氨基酸组成的48000μⅠ型膜蛋白分子，属于肿瘤坏死因子与神经生长因子受体家族，在多种组织细胞中均有表达。FasL基因定位于人的1号染色体长臂2区3带，总长约8.0kb，cDNA全长1909bp，开放性阅读密码框长846 bp，含有4个外显子和3个内含子。FasL(CD95L,APO-1L,CD178)蛋白是一类含有280个氨基酸(~40kDa)Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(ITF)超家族表面分子。FasL是Fas的天然受体，能够特异性地与靶细胞膜上的Fas结合诱导细胞凋亡。这种Fas/FasL系统介导的细胞凋亡途径是哺乳动物睾丸生精细胞凋亡的一条主要途径[13]，FasL能够特异性地与生精细胞膜上的Fas结合诱导其凋亡[13]。细胞凋亡途径有两条信号途径：一是胞外途径，二是胞内途径。胞内凋亡途径也称“线粒体途径”，此类信号包括辐射、损伤、药物如氧化砷等，这些信号往往通过各种机制引发线粒体功能和结构的变化，导致线粒体通透性转换孔打开，细胞色素C释放，最终致使细胞凋亡[14]。细胞外途径，是由FasL/Fas系统介导来完成，FasL也称“死亡信号”，故胞外凋亡途径又称“死亡信号”途径。FasL/Fas系统介导的胞外途径，它们在caspase 8(caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶简称，是一组有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶，与真核细胞凋亡密切相关，参与细胞因子的成熟、细胞生长和分化。在介导细胞凋亡中起重要作用[15]。)活化时又开始分道扬镳。细胞死亡抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL不能防止“Ⅰ型细胞”路径遭受死亡受体诱导的细胞死亡。Bcl-2、Bcl-xL能够明显抑制FasL/Fas介导的“Ⅱ型细胞”途径的细胞凋亡[16]，且发现在Bid缺失或Bax/Bak缺失的小鼠中，FasL/Fas系统介导的“Ⅱ型细胞”途径细胞凋亡被抑制[17]。
, 百拇医药
3FasL在睾丸细胞中的表达
FasL不仅在免疫细胞(T细胞)中表达，在免疫豁免的微环境如眼、脑、胎盘以及睾丸中表达丰富。支持细胞是曲细精管中的体细胞，位于曲细精管基底膜，是生精细胞的支架，为生精细胞提供营养，支持细胞间紧密连接构成血-睾屏障，为精子的生成提供免疫豁免的微环境[13]。FasL/Fas系统介导的胞外凋亡途径是生精细胞凋亡的一条普遍途径，膜上表达有Fas受体的生精细胞通过相邻的支持细胞或通过自身细胞表达的FasL来介导其凋亡[13]。Xu等采用杂交技术测出，在啮齿类成年动物的睾丸中，Fas表达于生精细胞，而FasL表达于支持细胞。普遍认为FasL定位于支持细胞；而Fas定位于生精细胞。在FasL/Fas系统介导的生精细胞凋亡中，由支持细胞分泌的FasL通过与膜上表达与有Fas的生精细胞相结合，以旁分泌形式介导生精细胞凋亡[13]。Kajihara等用免疫组化检测证实：FasL在正常成熟小鼠的支持细胞和生精细胞都有表达。这一结果表明FasL有可能来自支持细胞和生精细胞，它们可以通过旁分泌和自分泌的形式与生精细胞膜上的Fas受体结合，从而诱导生精细胞凋亡[18]。已经发现同一细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发使细胞发生“自杀(Suicide)”或分别表达Fas和FasL的相邻细胞互相交联导致“同胞残杀(Fratricide)”[19]。睾丸组织是机体的重要的免疫豁免区(Immune privileged sites)，其免疫豁免的维持依赖于Fas和FasL分子的介导的细胞凋亡机制[20]。如果Fas和FasL任何一个方遭受破坏都将产生不良后果。
, 百拇医药
间质细胞除在精子发生、成熟、维持睾丸的生殖功能发挥重要调节作用外，在抗感染免疫和维持免疫豁免中亦发挥重要的免疫调节作用。张颖德证实[21]，解脲脲原体(Uu)感染时，间质细胞可能通过改变IL-6和FasL、Fas分子的表达格局，来调节睾丸局部的抗感染免疫应答和睾丸局部的免疫豁免，从而维持两者的相对平衡，达到清除病原微生物(抗感染)、保护睾丸生理功能(免疫豁免)的双重目的[21]。难怪在Uu感染的患者精液进行生精细胞学分析时，可以看到间质细胞代偿性增生现象。表明间质细胞可以作为—免疫调节细胞，在抗感染免疫时，发挥免疫调节作用。作者提示：间质细胞不仅具有生殖功能还具有参与睾丸局部的免疫调节功能[21]。彭戈峰证实[22]Fas和FasL表达的强弱程度在睾丸同一细胞基本是一致的，睾丸支持细胞、间质细胞及生精细胞Fas和FasL的高表达与睾丸精子生成障碍是一致的，说明睾丸生殖细胞的过度凋亡是引起精子生成障碍的重要原因之一。Francavilla等[23]研究表明，在特发性低促性腺激素性腺功能低下症的病例中，Fas和FasL不表达。说明人类睾丸Fas和FasL的表达是在促性腺激素控制下实行调节，从而涉及产生精子的数量控制机制。说明Fas和FasL与激素的调控有关。
, 百拇医药
4抑癌基因p53
p53在睾丸内主要表达于生精细胞，且在性成熟前表达量非常高，而成年后大大降低。p53是抑癌基因，可以诱导自发性和损伤性生精细胞凋亡，具体过程包括：活化和氧化还原作用相关基因，产生活性氧，氧化降解线粒体组分，使得凋亡诱导因子从线粒体释放至胞质活化Caspases[7]。野生型p53(wtp53)基因能促进细胞凋亡的发生。它不仅在细胞有丝分裂中发挥作用，而且在生殖细胞的减数分裂中也显现出重要功能。有研究者在4倍体的粗线期精母细胞中发现了p53蛋白的表达。Rotter等[24]将重组p53启动子——氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因转入小鼠生殖细胞培育出转基因小鼠，这种小鼠体内内源性p53基因的表达水平降低，小鼠睾丸实质和曲细精管管腔分布着大量的多核细胞，称为“巨细胞退变综合征”。这些巨细胞实际上是不能完成减数分裂的4倍体粗线期精母细胞，阻滞在曲细精管中，必然会从精液中排出，为此，在精液脱落细胞学的检出中，可以看到多量的巨噬细胞，实际是粗线期精母细胞蜕变而来。故p53的表达水平越低，病理损害程度越重。在p53基因纯合性缺失的小鼠睾丸中也发现了多核巨细胞，某些基因背景的p53基因纯合性缺失的小鼠易发生精原细胞瘤、畸胎瘤和不育。可见，缺乏p53表达的生殖细胞不易凋亡，这是因为缺乏p53的粗线期精母细胞不能对减数分裂DNA重组中的错误进行修复，细胞不能进一步发展成熟进行减数分裂而停滞在该阶段，阻止了凋亡的发生[24]。精液脱落细胞学分析中，可以看到阻滞在初级精母细胞粗线期时，精液生精细胞脱落出现高峰期。Kilinc等通过小鼠睾丸的精索静脉曲张模型，发现p53在该模型小鼠睾丸内的表达强度明显高于正常对照组(P=0.01)表明p53与精索静脉曲张引起的生精细胞的凋亡密切相关[25]。
, 百拇医药
p63基因是p53基因家族中的一员，且与p53有着相似的蛋白空间结构。p63编码两种同源基因：含有N末端区域的TAP63基因和不含此区域的DeltaNp63基因。p63蛋白分布在精母细胞和精子细胞的核周质。推测p63可能与精子细胞的增殖、分化和凋亡也有某种关系[7]。
5热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)基因及其家族
HSPs是细胞在受到热损伤、物理、化学等刺激时合成的高度保守的一组蛋白，对于机体维持自身稳定起到重要的作用。热休克蛋白包括HSP110、HSP90、HSP70及泛素(Ubiquitin)等。其中HSP90广泛分布于未受刺激的哺乳动物的各类细胞中，能够促进细胞内其它蛋白质的合成、正确地折叠和运转[26]。正常成人睾丸中，HSP90和HSP27位于支持细胞、精原细胞、精母细胞和精子细胞的细胞质中，未与细胞质内的细胞器相连接。热刺激以后引起支持细胞、精原细胞和精母细胞核内HSP27和HSP90蛋白表达增高，主要出现在细胞核的染色质周原纤维(perichromatin fibrils ,PF)和核仁中。成熟的长型精子细胞，HSP的免疫荧光染色呈阴性，而残余体中则显示阳性。因此，HSP的转位可能起到了保护核内RNA的作用，而成熟的精子染色质高度浓缩，基因在周围碱性蛋白的保护下没有转录活性，也不需要HSP保护[27]。
共5页, http://www.100md.com(曹兴午 李翠英 袁长巍)
Fas是一个有319个氨基酸组成的48000μⅠ型膜蛋白分子，属于肿瘤坏死因子与神经生长因子受体家族，在多种组织细胞中均有表达。FasL基因定位于人的1号染色体长臂2区3带，总长约8.0kb，cDNA全长1909bp，开放性阅读密码框长846 bp，含有4个外显子和3个内含子。FasL(CD95L,APO-1L,CD178)蛋白是一类含有280个氨基酸(~40kDa)Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(ITF)超家族表面分子。FasL是Fas的天然受体，能够特异性地与靶细胞膜上的Fas结合诱导细胞凋亡。这种Fas/FasL系统介导的细胞凋亡途径是哺乳动物睾丸生精细胞凋亡的一条主要途径[13]，FasL能够特异性地与生精细胞膜上的Fas结合诱导其凋亡[13]。细胞凋亡途径有两条信号途径：一是胞外途径，二是胞内途径。胞内凋亡途径也称“线粒体途径”，此类信号包括辐射、损伤、药物如氧化砷等，这些信号往往通过各种机制引发线粒体功能和结构的变化，导致线粒体通透性转换孔打开，细胞色素C释放，最终致使细胞凋亡[14]。细胞外途径，是由FasL/Fas系统介导来完成，FasL也称“死亡信号”，故胞外凋亡途径又称“死亡信号”途径。FasL/Fas系统介导的胞外途径，它们在caspase 8(caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶简称，是一组有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶，与真核细胞凋亡密切相关，参与细胞因子的成熟、细胞生长和分化。在介导细胞凋亡中起重要作用[15]。)活化时又开始分道扬镳。细胞死亡抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL不能防止“Ⅰ型细胞”路径遭受死亡受体诱导的细胞死亡。Bcl-2、Bcl-xL能够明显抑制FasL/Fas介导的“Ⅱ型细胞”途径的细胞凋亡[16]，且发现在Bid缺失或Bax/Bak缺失的小鼠中，FasL/Fas系统介导的“Ⅱ型细胞”途径细胞凋亡被抑制[17]。
, 百拇医药
3FasL在睾丸细胞中的表达
FasL不仅在免疫细胞(T细胞)中表达，在免疫豁免的微环境如眼、脑、胎盘以及睾丸中表达丰富。支持细胞是曲细精管中的体细胞，位于曲细精管基底膜，是生精细胞的支架，为生精细胞提供营养，支持细胞间紧密连接构成血-睾屏障，为精子的生成提供免疫豁免的微环境[13]。FasL/Fas系统介导的胞外凋亡途径是生精细胞凋亡的一条普遍途径，膜上表达有Fas受体的生精细胞通过相邻的支持细胞或通过自身细胞表达的FasL来介导其凋亡[13]。Xu等采用杂交技术测出，在啮齿类成年动物的睾丸中，Fas表达于生精细胞，而FasL表达于支持细胞。普遍认为FasL定位于支持细胞；而Fas定位于生精细胞。在FasL/Fas系统介导的生精细胞凋亡中，由支持细胞分泌的FasL通过与膜上表达与有Fas的生精细胞相结合，以旁分泌形式介导生精细胞凋亡[13]。Kajihara等用免疫组化检测证实：FasL在正常成熟小鼠的支持细胞和生精细胞都有表达。这一结果表明FasL有可能来自支持细胞和生精细胞，它们可以通过旁分泌和自分泌的形式与生精细胞膜上的Fas受体结合，从而诱导生精细胞凋亡[18]。已经发现同一细胞自身的Fas和FasL交联，通过顺式触发使细胞发生“自杀(Suicide)”或分别表达Fas和FasL的相邻细胞互相交联导致“同胞残杀(Fratricide)”[19]。睾丸组织是机体的重要的免疫豁免区(Immune privileged sites)，其免疫豁免的维持依赖于Fas和FasL分子的介导的细胞凋亡机制[20]。如果Fas和FasL任何一个方遭受破坏都将产生不良后果。
, 百拇医药
间质细胞除在精子发生、成熟、维持睾丸的生殖功能发挥重要调节作用外，在抗感染免疫和维持免疫豁免中亦发挥重要的免疫调节作用。张颖德证实[21]，解脲脲原体(Uu)感染时，间质细胞可能通过改变IL-6和FasL、Fas分子的表达格局，来调节睾丸局部的抗感染免疫应答和睾丸局部的免疫豁免，从而维持两者的相对平衡，达到清除病原微生物(抗感染)、保护睾丸生理功能(免疫豁免)的双重目的[21]。难怪在Uu感染的患者精液进行生精细胞学分析时，可以看到间质细胞代偿性增生现象。表明间质细胞可以作为—免疫调节细胞，在抗感染免疫时，发挥免疫调节作用。作者提示：间质细胞不仅具有生殖功能还具有参与睾丸局部的免疫调节功能[21]。彭戈峰证实[22]Fas和FasL表达的强弱程度在睾丸同一细胞基本是一致的，睾丸支持细胞、间质细胞及生精细胞Fas和FasL的高表达与睾丸精子生成障碍是一致的，说明睾丸生殖细胞的过度凋亡是引起精子生成障碍的重要原因之一。Francavilla等[23]研究表明，在特发性低促性腺激素性腺功能低下症的病例中，Fas和FasL不表达。说明人类睾丸Fas和FasL的表达是在促性腺激素控制下实行调节，从而涉及产生精子的数量控制机制。说明Fas和FasL与激素的调控有关。
, 百拇医药
4抑癌基因p53
p53在睾丸内主要表达于生精细胞，且在性成熟前表达量非常高，而成年后大大降低。p53是抑癌基因，可以诱导自发性和损伤性生精细胞凋亡，具体过程包括：活化和氧化还原作用相关基因，产生活性氧，氧化降解线粒体组分，使得凋亡诱导因子从线粒体释放至胞质活化Caspases[7]。野生型p53(wtp53)基因能促进细胞凋亡的发生。它不仅在细胞有丝分裂中发挥作用，而且在生殖细胞的减数分裂中也显现出重要功能。有研究者在4倍体的粗线期精母细胞中发现了p53蛋白的表达。Rotter等[24]将重组p53启动子——氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因转入小鼠生殖细胞培育出转基因小鼠，这种小鼠体内内源性p53基因的表达水平降低，小鼠睾丸实质和曲细精管管腔分布着大量的多核细胞，称为“巨细胞退变综合征”。这些巨细胞实际上是不能完成减数分裂的4倍体粗线期精母细胞，阻滞在曲细精管中，必然会从精液中排出，为此，在精液脱落细胞学的检出中，可以看到多量的巨噬细胞，实际是粗线期精母细胞蜕变而来。故p53的表达水平越低，病理损害程度越重。在p53基因纯合性缺失的小鼠睾丸中也发现了多核巨细胞，某些基因背景的p53基因纯合性缺失的小鼠易发生精原细胞瘤、畸胎瘤和不育。可见，缺乏p53表达的生殖细胞不易凋亡，这是因为缺乏p53的粗线期精母细胞不能对减数分裂DNA重组中的错误进行修复，细胞不能进一步发展成熟进行减数分裂而停滞在该阶段，阻止了凋亡的发生[24]。精液脱落细胞学分析中，可以看到阻滞在初级精母细胞粗线期时，精液生精细胞脱落出现高峰期。Kilinc等通过小鼠睾丸的精索静脉曲张模型，发现p53在该模型小鼠睾丸内的表达强度明显高于正常对照组(P=0.01)表明p53与精索静脉曲张引起的生精细胞的凋亡密切相关[25]。
, 百拇医药
p63基因是p53基因家族中的一员，且与p53有着相似的蛋白空间结构。p63编码两种同源基因：含有N末端区域的TAP63基因和不含此区域的DeltaNp63基因。p63蛋白分布在精母细胞和精子细胞的核周质。推测p63可能与精子细胞的增殖、分化和凋亡也有某种关系[7]。
5热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)基因及其家族
HSPs是细胞在受到热损伤、物理、化学等刺激时合成的高度保守的一组蛋白，对于机体维持自身稳定起到重要的作用。热休克蛋白包括HSP110、HSP90、HSP70及泛素(Ubiquitin)等。其中HSP90广泛分布于未受刺激的哺乳动物的各类细胞中，能够促进细胞内其它蛋白质的合成、正确地折叠和运转[26]。正常成人睾丸中，HSP90和HSP27位于支持细胞、精原细胞、精母细胞和精子细胞的细胞质中，未与细胞质内的细胞器相连接。热刺激以后引起支持细胞、精原细胞和精母细胞核内HSP27和HSP90蛋白表达增高，主要出现在细胞核的染色质周原纤维(perichromatin fibrils ,PF)和核仁中。成熟的长型精子细胞，HSP的免疫荧光染色呈阴性，而残余体中则显示阳性。因此，HSP的转位可能起到了保护核内RNA的作用，而成熟的精子染色质高度浓缩，基因在周围碱性蛋白的保护下没有转录活性，也不需要HSP保护[27]。
共5页, http://www.100md.com(曹兴午 李翠英 袁长巍)