透明质酸酶
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中图分类号：Q55文献标识码：E文章编号：1672-979X(2007)04-0074-03
1 透明质酸酶及透明质酸
透明质酸酶 (hyaluronidase, HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称。根据全国科学技术名词审定委员会公布的《生物化学名词》将hyaluronic acid译为透明质酸，《药学名词》和药品的国家标准则将其称为玻璃酸，两者为同一种物质，故透明质酸酶亦称为玻璃酸酶[1]。
根据来源和作用的不同，HAase分为3类：(1)睾丸型HAase，主要来源为动物睾丸、颌下腺和溶酶体等；(2)透明质酸内-β-葡萄糖醛酸苷酶，来源为水蛭的唾液腺；(3)细菌HAase，又称透明质酸裂解酶，这是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶，能催化透明质酸及硫酸软骨素 A、C的β-乙酰氨基己糖糖苷键水解[2]。根据最适pH值的不同将脊椎动物的HAase分为中性型和酸性型2类。最适pH为5左右者是中性型HAase，如睾丸、一些微生物、蛇和昆虫毒素所含的HAase；最适pH为3.5~4.0者，是酸性型HAase，如正常人血清、尿、肝脏含有的HAase，肿瘤组织中的HAase也是酸性型。
HAase的专一性水解底物-透明质酸(HA)是一种糖胺聚糖(GAG，亦称黏多糖)。HA是由双糖单位重复连接构成的直链高分子多糖。其双糖单位中的D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺以β-1,3糖苷键相连，分子中2种单糖的摩尔比为1:1，双糖单位间则以β-1,4糖苷键连接[1-4]。它是唯一不限于动物组织，并产生于细菌的糖胺聚糖，广泛存在于动物结缔组织的细胞外基质中，在胚胎、滑液、玻璃体、脐带、鸡冠等组织中尤为丰富。它在体内具有很多作用，如构成多种基质，调节渗透压，调控大分子物质转运，在细胞周围形成物理屏障等。
2HAase的基本性质
不同来源的HAase相对分子质量不同。牛睾丸及精液HAase相对分子质量为6.1×104，蝎毒的为5.4×104，尖吻蝮蛇的为3.3×104，细菌的则高达15×104[2]。蜂毒中HAase的分子结构尚不完全清楚，但已知其相对分子质量约为(4.2~4.4)×104，N端为精氨酸，分子中含有18个酪氨酸和少量的丙氨酸、苏氨酸，无游离的巯基，分子中还含有半乳糖、果糖和甘露糖。从等电点看，所有动物毒中的HAase都是碱性的，这不同于睾丸的HAase(酸性蛋白)和细菌的HAase(中性蛋白)[5]。
3HAase的制备
由于现在市场上使用的HAase大多是从哺乳动物睾丸中提取的，现将从羊睾丸中提取HAase的传统工艺及目前研究的热点—从蛇毒提取 HAase的工艺做一简介。
3.1从羊睾丸中制备HAase的传统工艺
3.1.1提取新鲜睾丸除去内外副睾，绞成糜浆，称取400 g倒入预先配制的冷醋酸液(水360 g，冰醋酸204 mL，l mol/L 盐酸40 mL)中，在-5 ℃以下提取4 h，吊滤，得提取液。浆渣作2次提取，提取液量为第1次的1/3。
3.1.2盐析在不断搅拌下，每升提取液加入固体硫酸铵(工业用)210 g，完全溶解后静止1 h，用双层涤纶布袋吊滤过夜，得清液，不断搅拌。每升清液再加入固体硫酸铵290 g，完全溶解后静止1 h，吊滤过夜，得潮固体。
3.1.3精制将粗品溶于少量水中，装入透析袋，置入100 mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，在10 ℃左右透析24 h后过滤，得透析液，再冰浴冷却，加入15%磷酸钠(12H2O)0.5 mL，不断搅拌下缓缓加入20%醋酸钙溶液0.3 mL，并用氢氧化钠液调pH至8.5，抽滤，滤液用盐酸调pH至7.0，冷冻干燥，得无热原HAase精品。
3.2从蛇毒中制备取HAase的工艺
有人用凝胶过滤法从尖吻蛇毒中纯化出透明质酸酶，并用SDS-PAGE法测得其相对分子质量为3.3×104 [6]。以尖吻蝮蛇(A . acutus)蛇毒为原料，在4℃左右的低温下纯化得到HAase。步骤为：(1)CM-Sephadex C-50阳离子交换层析；(2)Sephadex G-75分子筛层析；(3)CM-Sephadex C-25阳离子交换层析。用SDS-PAGE法测得其相对分子质量为3.3×104，等点聚焦测得等电点为10.3，并通过糖染色法证明HAase是糖蛋白[3]。
4HAase的应用
4.1麻醉辅助剂
ISTA制药公司于2004年12月3日宣布，美国FDA已批准其单剂量小包装注射用绵羊透明质酸酶(Vitrase)无菌液作为分散剂，可用于促进其它药物分散和吸收[7]。本品在眼科手术时常与局部麻醉药合用。
4.2促使皮下注射液迅速扩散
HAase通过对黏多糖HA的解聚作用，能加速物质的扩散和吸收，促使皮下注射液或局部积贮的渗出液、血液等的扩散和吸收，是一种重要的药物扩散剂，还有消除血肿和水肿的作用，与其他注射液(如生理盐水、抗生素、肾上腺素等)合用，可促使皮下注射液迅速吸收。
4.3用于肿瘤检测
目前对分离的肿瘤细胞和肿瘤间质细胞检测表明，肿瘤间质细胞只分泌HA，肿瘤细胞则能同时分泌HA和HAase，并且随肿瘤细胞侵袭性的增强而增强。此外，HA和HAase在恶性肿瘤患者的体液(血清、腹水)和排泄物(唾液、尿液)中明显升高，经统计学分析具有很高的灵敏性和特异性，可作为理想的肿瘤标记物。Lokeshwar等[8]对513例尿样的分析表明，膀胱癌患者尿液中HA的含量是非膀胱癌患者2.5~6.5倍；G2，G3期膀胱癌患者尿液中的HAase含量是非膀胱癌患者的3~7倍。HA和HAase联合测定分析结果，其特异度和灵敏度分别达到84.4%和91.9%。最值得关注的是测定HA/HAase有助于及早发现隐匿性肿瘤和复发肿瘤，及判断肿瘤的发展阶段。
4.4可促扩散、化痰消肿以及治疗肠粘连及青光眼
治疗青光眼使用HAase能加速和促进液体穿通组织屏障进入眼眶组织，麻醉过程中勿需压迫眼球，避免了对视神经的压迫，并能避免眼球穿通伤患者眼内容物进一步脱出的危险。
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