体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察(2)
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1.2方法
1.2.1兔MSCs的分离培养用肝素化的无菌注射器抽取骨髓液4~5 ml，淋巴细胞分离法提取MSC，以细胞数1×105个/ml，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中恒温培养。于第3天取出培养瓶，倒掉细胞悬液(其中含未贴壁细胞)，以后每3～4天换液1次。观察细胞达80%融合后，加入1∶1的2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA混合液，消化，传代，MSCs重新接种至两个75 ml培养瓶中，反复传代、扩增、纯化，传至第4代备用[4]。
1.2.2兔软骨细胞的分离与培养将青紫蓝兔血栓处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取出软骨，将软骨切成1～3 mm3大小置无菌试管，PBS冲洗3次，800转/min离心3 min，吸去PBS，加2 g/L胰酶4 ml，CO2孵箱30 min，吸出胰酶后再加入2 g/LⅡ型胶原酶5 ml，置孵箱内消化6～8 h。观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800 转/min离心3 min，用培养液洗2次。细胞记数后移入25 ml培养瓶中，使细胞密度为2×104个/L，加DMEM-F12培养液(含100 ml/L胎牛血清，1×105 U/L青霉素，50 mg/L维生素C，0.15 g/L谷氨酰胺)，于37℃，CO2孵箱中培养，每2天换液1次。原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养 ......
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