兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2667KB，3页)。
1.2.1.2 MTT法测定MSCs贴壁率取生长良好的细胞消化传代，以相同密度接种于96孔板中。2、4、8、24 h后换液，去除未贴壁细胞，添加新鲜培养基200 μl，四甲基偶氮唑盐20 μl, 37℃ 孵育4～6 h。弃孔内培养液, 每孔加入200 μl DMSO, 振荡10 min, 吸出孔内液体并放入新96孔板中,在酶标仪上测定490 nm 波长处各孔的吸光度值, 并对数值进行统计学处理[10,11]。以未换液组作为对照。
1.2.1.3 骨髓MSCs的体外诱导软骨形成取第4 代MSCs , 胰酶消化, 以5×104/ml 细胞密度接种于24 孔板中，在含10%胎牛血清的完全培养液中培养，并加入地塞米松10 U/L，bFGF 10 g/L，维生素C 50 mg/L，在37℃、5%CO2孵箱内培养1周，换液2次。从第2周起用TGF-β1 10 g/L 替换bFGF，继续培养3周，随时观察细胞形态变化并摄片[10-12]。分别于诱导的第3、6、9、12 天进行MTT检测，方法同上。并以同时培养的MSCs作为对照。
1.2.1.4 Ⅱ型胶原的表达制备实验组及对照组细胞爬片，取出爬片后，以4%多聚甲醛固定，并经氧化物酶阻断溶液浸泡。正常山羊血清封闭，依次加入：一抗(鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体)，4℃过夜；二抗(生物素化羊抗鼠IgG)、链霉亲和素-过氧化物酶复合物室温孵育30 min。上述各步骤间均用PBS洗涤，然后显色，脱水，透明, 封片，计算阳性率[13-15]。
1.2.2 体内实验取牛Ⅱ型胶原酸性溶液与两倍浓度的培养液0.5 ml混合，分别加入上述诱导前后的两种MSCs，终浓度为5×105 /ml，再加入约20 g/L 冻干人纤维蛋白原，充分溶解后加入凝血酶0.1 ml (含凝血酶约25 U)。放入37℃孵箱内，5 min后即成为细胞载体复合物。分别将该复合物移植于白兔膝关节内(实验组及对照组各15例)，3周后处死动物并观察培养结果。检测方法：X线观察，分别于术后4、6、8周时处死实验动物 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2667KB，3页)。