甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12的影响(2)
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仪器：8453型紫外-可见分光光度计(Agilent公司)；HP 1100型色谱仪(Agilent公司)。
试剂：氰钴胺对照品(含量>99%，河北华荣制药有限公司)，糖蜜(内蒙古兰田糖业有限公司)，甜菜碱(河北华荣制药有限公司)，DMBI(河北科硕化工有限公司)，CoCl2·6H2O(山东临县汇丰钴厂)，ALA (Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。
1.3 发酵培养方法
种子培养：用无菌水刮洗下斜面菌体，制成菌悬液。取1 ml菌悬液接入装有60 ml种子培养基的300 ml三角瓶中，30 ℃，260 r/min旋转式摇床振荡培养至菌体吸光值(OD700)为10左右。摇瓶培养：300 ml三角瓶中培养基装量为36 ml，接种量10%，32 ℃，于旋转式摇床(260 r/min)培养至96 h。
1.4测定方法
菌体浓度(DCW)：采用测量菌体干重法(dry cell weight)。吸10 ml发酵液，经离心和洗涤后，菌体烘干至恒重，称菌体干重。VB12测定：采用HPLC法。将被测样品中不同形式的VB12转化为氰钴胺，流动相：V(250 mmol/L磷酸水溶液)∶V(乙腈)= 30∶70；色谱柱：大连依利特Hypersil NH2柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；检测波长：361 nm；进样量：20 μl；流速：1.7 ml/min。甜菜碱测定：比色法[12]，利用甜菜碱与雷氏盐发生反应。δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的测定：按照文献[13]的方法进行测定。
2 结果与讨论
2.1 两种不同甲基供体对菌体生长和VB12合成的影响
甜菜碱和氯化胆碱每个分子都含有三个甲基，常常作为发酵产VB12过程的甲基供体。为了比较二者对P. denitrificans发酵产VB12的影响，在发酵培养基中分别加入10 g/L的甜菜碱、氯化胆碱 ......
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