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编号:11702823
乌司他丁对胃癌细胞c-met基因表达及增殖的影响研究(2)
http://www.100md.com 2008年11月5日 崔 宁
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    参见附件(403KB,3页)。

     1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞人胃癌细胞株BGC-823细胞由中科院上海细胞生物所细胞库提供。

    1.1.2 主要试剂奥沙利铂(L-OHP,江苏恒瑞医药股份有限公司),乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司),RPMI 1640(美国GIBCO公司),小牛血清(浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司),抗c-met基因蛋白抗体为鼠抗人单克隆抗体(S-19),酶联免疫吸附试剂盒(Santa Cruz公司);1:125胰蛋白酶(美国GIBCO公司),RNArose Reagent(上海华舜生物工程有限公司);Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0[宝生物工程(大连)有限公司],ANGPTL3引物和β-actin引物(上海生物工程技术服务有限公司)。

    1.1.3 主要仪器酶联免疫检测仪(美国EL340型)。

    1.2 方法

    1.2.1 人胃癌细胞培养BGC-823细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液、37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,用4 g/L台盼蓝染色后计算细胞存活率,并进行活细胞计数,调整细胞悬液密度为5×104/ml备用。

    1.2.2 c-met mRNA表达检测将备用的细胞悬液接种于6孔板中,500 μl/孔,分为空白组、对照组(1 mmol/L、0.5 mmol/L)和乌司他丁组(320 U/ml、160 U/ml),每组设4个复孔。4 h细胞完全贴壁后加入受试药物,空白组加入RPMI 1640培养液3 ml,对照组培养液中加入L-OHP至终浓度为1 mmol/L(1组)和0.5 mmol/L(2组),乌司他丁组培养液中加入乌司他丁至终浓度为320 U/ml(1组)和160 U/ml(2组),分别置于培养箱中培养48 h。按RNArose Reagent使用说明提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法[Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0]检测c-met mRNA表达情况。

    c-met引物设计:

    正义链 5'-TCTTCTTCCTCGGACTCGCT-3';

    反义链 5'-GGTGTCGTTTGGAGGTGTGT-3';

    引物长度228 bp ......

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