大鼠胃黏膜电切术后止血治疗前后局部组织中CTGF和EGF-R的变化(2)
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1 材料与方法
1.1 实验动物
48只成年健康SD大鼠(湖南省长沙市开福区东创实验动物科技服务部)分成4组。雌雄各半，体重(200±13) g，分笼喂养。室温(23±2)℃，实验前适应性喂养1周。见表1。
表1 实验大鼠的分组及一般情况(x±s，g)
1.2 实验动物模型的建立
1.2.1 实验动物的手术步骤：术前24 h禁食，8 h禁饮。腹腔内注射麻醉(10%水合氯醛3 ml/kg)后，无菌条件下取左侧腹直肌切口入腹腔，将胃钳拉出腹壁外，在胃窦前壁切开胃，切口约5 mm，在距切口约5 mm处的胃窦黏膜下注射生理盐水至黏膜隆起，用单极电刀(CHR-EⅢ多功能手术仪，武汉春光医疗美容仪器有限公司)电切隆起的胃黏膜，切除面约3 mm×3 mm。关闭胃腔及腹腔，常规消毒、包扎腹壁切口。所有动物术后禁食、禁饮24 h。
1.2.2术后观察及给药：术后用酚磺乙胺注射液(国药准字H52020796，贵州光正制药有限责任公司，0.09 mg/kg)和6-氨基己酸注射液(国药准字H32021913，常州兰陵制药有限公司，0.72 mg/kg)行腹腔内注射，2次/d。未治疗组术后用等量生理盐水腹腔注射。酚磺乙胺组、6-氨基己酸组和未治疗组分别于术后第1、2、4周用离断颈椎法分批处死大鼠。正常对照组不做特殊处理，适应性喂养1周后处死。
1.3 免疫组化法测定CTGF及EGF-R
1.3.1 各组动物处死后，解剖出胃，留取电切术后局部胃壁组织，用10%中性甲醛溶液固定24 h。常规石蜡包埋、切片备用。
1.3.2 用SABC法(SA1025-大鼠IgG，SA1022-大鼠IgG，武汉博士德生物工程有限公司)进行免疫组化染色。煮沸法修复抗原，修复液为0.01 mol/L橘橼酸盐缓冲液(pH 6.0)。CTGF一抗为兔抗鼠结缔组织生长因子(rabbit anti-CTGF，1∶100)，EGF-R一抗为兔抗鼠表皮生长因子受体(rabbit anti-EGF-R，1∶100)。DAB显色(AR1022，武汉博士德生物工程有限公司)、中性树胶封片观察，各组以PBS设立阴性对照。
1.3.3 采用Image Pro Plus图象分析软件进行半定量分析，每个样本随机选择5个高倍视野(×200)，测定阳性表达部位的积分密度值(IOD)。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差(x±s)表示，进行完全随机设计方差分析，多个样本间均数两两比较用q检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组动物胃组织中CTGF的测定
正常组CTGF阳性染色主要在上皮细胞间和黏膜下层的结缔组织中。未治疗组除上述部位阳性染色外，部分壁细胞质内和黏膜下层的血管内皮细胞的胞质中也出现明显的阳性染色。经酚磺乙胺或6-氨基己酸治疗后，CTGF阳性染色同时出现在胃壁细胞内和结缔组织中。见图1。
在同一时间点上，未治疗组、酚磺乙胺组和6-氨基己酸组胃电切术后周边黏膜的IOD都较正常对照组明显升高(P<0.05)，而酚磺乙胺组、6-氨基己酸组的IOD又较未治疗组明显升高(P<0.05)。酚磺乙胺组与6-氨基己酸组的IOD相比，无显著性差异(P>0.05)，见表2。
表2 CTGF在各组动物胃组织中阳性染色的IOD(x±s)
与正常对照组比较，*P<0.05；与未治疗组比较，#P<0.05
在同一组内的不同时间相比，未治疗组的IOD在术后第14天达最大值，但与第7天及第28天相比，无显著性差异(P>0.05)。酚磺乙胺组和6-氨基己酸组的IOD都在术后第14天达最大值，较同组内第7天、第28天明显增加(P<0.05)，同组内第7天和第28天相比，无显著性差异(P>0.05)，见表2。
2.2 各组动物胃组织中EGF-R的测定
在正常大鼠中，EGF-R阳性表达主要位于胃黏膜浅层壁细胞膜上及胞质中，呈弱阳性染色。术后EGF-R主要表达于溃疡边缘组织的胃腺颈部及基底部的颈黏液细胞、壁细胞胞质中，其染色强度较正常组织深，在炎性渗出及坏死层未见EGF-R阳性染色。见图2。
图2大鼠胃黏膜电切创面胃壁组织中EGF-R的变化(IHC×400)
(A：正常对照组7 d；B：未治疗组7 d；C：酚磺乙胺组7 d；D：6-氨基己酸组7 d；E：正常对照组14 d；F：未治疗组14 d；G：酚磺乙胺组14 d；H：6-氨基己酸组14 d；I：正常对照组28 d；J：未治疗组28 d；K：酚磺乙胺组28 d；L：6-氨基己酸组28 d)
在同一时间点上，未治疗组、酚磺乙胺组和6-氨基己酸组胃电切术后周边黏膜的IOD都较正常组明显升高(P<0.05)，而酚磺乙胺组、6-氨基己酸组的IOD又较未治疗组明显升高(P<0.05)。酚磺乙胺组与6-氨基己酸组相比，第14天时酚磺乙胺组的IOD明显增高(P<0.05)，而在第7天和第28天则无显著性差异(P>0.05)，见表3。
在同一组内的不同时间点相互比较，未治疗组的IOD各时间点之间无显著性差异(P>0.05)。酚磺乙胺组和6-氨基己酸组的IOD均在术后第14天达最大值，较第7天和第28天明显增加(P<0.05)，同组内第7天和第28天相比，无显著性差异(P>0.05)，见表3。
表3 EGF-R在各组动物胃组织中阳性染色的IOD(x±s)
与正常对照组比较，*P<0.05；与未治疗组比较，#P<0.05
3 讨论
胃黏膜病变及黏膜下表浅病变的胃镜下行高频电切术对局部切除后创面有一定的止血功能，但是术后出血仍是常见的并发症之一，特别是延迟出血。因此，在胃黏膜病变电切术后临床上常规给予止血治疗，以期减少出血的发生。而切除病变后留下的黏膜缺损，由上皮细胞和结缔组织修复。CTGF、EGF及其受体在这一过程中起重要作用[1]。
正常大鼠胃黏膜下层及上皮细胞间CTGF呈弱阳性表达，说明少量的CTGF即可以确保胃壁内结缔组织的生理性更新，使得结缔组织中的相关成分处于一种动态平衡。而未治疗组第4周CTGF除黏膜下层、黏膜固有层出现阳性染色外，部分壁细胞也出现阳性染色 ......
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