血管活性肠肽在胃腺癌组织及细胞中的表达及意义(2)
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1.2.4 RT-PCR反应用Trizol法提取胃腺癌组织或细胞中的总RNA;逆转录获得cDNA后进行PCR扩增,反应体系为:10×PCR Buffer 5 μl,MgCl2 3 μl,dNTP Mix 5 μl,cDNA 7 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,Taq DNA聚合酶0.5 μl,总体积50 μl。反应条件如下:94℃ 5 min,94℃ 1 min→60℃ 1 min→72℃ 1 min,共30个循环,72℃ 10 min。
1.3结果判定
免疫组织化学染色结果判定:DAB显色后,显微镜下有棕黄色颗粒状物或棕黄色串珠形排列的物质为VIP阳性细胞或阳性神经纤维。组织的RT-PCR结果用OD值表示,正常胃组织与胃腺癌组织OD值与内参照β-actin OD值对比。
1.4统计学方法
结果用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 11.5统计软件进行独立样本t检验,P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果
2.1.1 组织免疫组化染色结果12例(12/30)胃腺癌组织出现VIP免疫反应阳性细胞,相对正常的胃组织中均未见VIP阳性细胞,经精确概率法检验显示,有显著性差异(P<0.01)。胃腺癌组织中无阳性神经纤维,而20例(20/20)相对正常的胃组织中均有阳性神经纤维存在,经精确概率法检验显示,有显著性差异(P<0.01)。
2.1.2胃腺癌细胞免疫组化染色结果胃腺癌SGC-7901细胞为VIP免疫反应阳性细胞,其免疫反应阳性颗粒大多在胞质,也有少许胞核染色。见图1。
图1 免疫组化染色显示胃癌细胞系SGC-7901 VIP阳性
2.2 RT-PCR反应结果
2.2.1 组织RT-PCR反应结果采用RT-PCR法从正常胃组织和胃腺癌组织总RNA中扩增出VIP目的基因,产物长度约为390 bp(图2)。通过凝胶图像扫描仪对DNA电泳条带做光密度分析,与内参照比较,VIP在胃腺癌组织中OD值大于正常胃组织OD值,有显著性差异(P<0.05)。见表1。
2.2.2腺癌细胞RT-PCR反应结果腺癌细胞总RNA中也能扩增出VIP目的基因。
3 讨论
许多胃肠激素对肿瘤的增殖、转移有重要的影响,而且一些肿瘤能分泌胃肠激素,对自身的生物学特性有着重要的影响。胃腺癌组织中也发现有内分泌能力的肿瘤细胞。Tzaneva[2]对56例胃腺癌组织进行免疫组化染色发现,30.4%的胃腺癌中具有内分泌细胞,但这些细胞是否分泌VIP未进行研究。于庆生等[3]为了探讨健脾通里中药芪黄煎剂对胃癌手术后VIP的调节,将30例欲行胃癌手术的患者随机分为研究组和对照组,分别观察两组VIP的变化,结果显示胃癌患者VIP术前高表达,术后1 d高于正常水平,术后7 d基本恢复正常,与对照组相比,术后应用中药芪黄煎剂能有效调节术后VIP的变化。Qvigstad等[4]通过内分泌细胞的标志抗原嗜铬粒素的免疫组化染色发现,17%~75%的胃腺癌组织含有内分泌细胞。本实验为阐明VIP在胃腺癌中的作用,用免疫组化方法观察胃腺癌组织和细胞中是否存在VIP蛋白,是否存在分泌VIP的肿瘤细胞。用RT-PCR方法观察胃腺癌组织和细胞中mRNA的表达。
笔者在以前的研究中发现,胃溃疡组织中有VIP阳性细胞存在,并且其mRNA的表达明显高于正常胃组织[5]。胃腺癌组织免疫组织化学染色结果显示,胃腺癌组织有VIP免疫阳性细胞,而正常对照组无免疫阳性细胞,有显著性差异,与李国华等[6]的研究结果相符。陈晖等[7]通过免疫组化方法,检测30例正常胃窦黏膜、30例不典型增生胃黏膜和74例胃腺癌组织中VIP蛋白的表达,以及胃腺癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27中VIP蛋白的表达,结果显示,48.6%的胃腺癌组织中发现VIP阳性细胞,13.3%的不典型增生及10.0%的正常胃窦黏膜存在VIP阳性细胞,胃腺癌细胞株VIP蛋白呈高水平表达。对阳性神经纤维的观察发现,正常胃黏膜间质中可见VIP 阳性神经纤维,而胃腺癌组织中未见阳性神经纤维。Sitohy等[8]发现,用化学药物诱导的大鼠结肠癌中,其病变组织中的VIP免疫阳性的神经纤维数量改变,推测局部神经的异常也可能参与了肿瘤的病变过程。
李国华等[9]采用RT-PCR检测30例功能性消化不良患者和15例正常对照组胃窦黏膜VIP mRNA的表达,结果显示,运动障碍性消化不良患者胃窦黏膜VIP mRNA表达量显著增多,胃窦黏膜VIP mRNA的表达改变可能参与了运动障碍性消化不良的发病。李国华等[10]还发现,肠型胃腺癌组织VIP mRNA表达明显高于不典型增生胃黏膜,VIP可能在肠型胃腺癌的发生及发展中起重要作用。VIP mRNA在胃腺癌组织中表达上调,而VIPR mRNA表达下调,胃腺癌组织中存在分泌VIP的内分泌细胞[11]。本结果显示,在胃腺癌组织中VIP的OD值大于正常胃组织OD值,有显著性差异,说明胃腺癌组织中VIP mRNA很可能来源于肿瘤细胞。而通过对胃腺癌细胞株中VIP mRNA的检测结果进一步证实了VIP mRNA来源于胃腺癌细胞。胃腺癌细胞不仅表达VIP mRNA,而且是VIP免疫阳性细胞,表明SGC-7901细胞具有VIP的自分泌调节作用[12]。
总之,胃腺癌组织及细胞中VIP蛋白和mRNA的改变,表明VIP在胃腺癌的发生和发展中起着重要的作用。
[参考文献]
[1]Nagakawa O, Murata J, Junicho A, et al. Vasoactive intestinal peptide (VIP) enhances the cell motility of androgen receptor-transfected DU-145 prostate cancer cells (DU-145/AR) [J]. Cancer Lett,2002,176(1):93-99.
[2]Tzaneva MA. Endocrine cells in gastric carcinoma and adjacent mucosa. An immunohistochemical and ultrastructural study [J]. Histochem J,2002,34(3-4):173-180.
[3]于庆生,潘晋方,喻宗繁,等.胃癌术后早期小肠内滴注芪黄煎剂对胃动素、血管活性肠肽、生长抑素的影响[J] ......
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