丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2425KB，3页)。
1.2 方法
1.2.1 重组表达载体的构建与鉴定在PubMed上查询HCV-NS5A基因序列,在编码区的上游和下游设计合成一对寡聚核苷酸引物,引物两端分别引入EcoR V/HindⅢ酶切位点。以实验室保存的HCV株全长cDNA进行PCR扩增,电泳鉴定,切胶、玻璃奶纯化目的片段。将目的基因片段与pGEM-T载体连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,活化后铺氨苄青霉素LB琼脂平板进行抗生素筛选。挑取单克隆菌落于1% AMP的LB培养基中增菌,提取质粒DNA后进行EcoR V/HindⅢ双酶切鉴定,回收目的基因片段,测序进行再次鉴定。
1.2.2 融合蛋白的诱导表达将已经鉴定正确的阳性重组基因单克隆菌落与pET-32a(+)空载体菌液分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、230 r/min培养过夜;第2天按1∶100扩增,37℃、230 r/min培养至细菌密度约为A600=0.5时,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养3～4 h,吸取3 ml培养液离心集菌,5 min冰浴后,11 000 r/min离心4 min,弃上清,100 μl 1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)悬浮菌体沉淀,加35 μl 5× SDS凝胶上样缓冲液及4 μl β-巯基乙醇,煮沸8 min,11 000 r/min离心4 min。取20 μl进行SDS-PAGE分析。
1.2.3 融合蛋白的Western blot检测SDS-PAGE电泳后将凝胶按常规方法转膜,以胎牛血清封闭,加入抗His单克隆抗体作为一抗1:250稀释孵育4 h,TBST洗膜3次,再加入HRP标记羊抗鼠IgG 1∶10 000稀释作为二抗孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL显色,X线片曝光 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2425KB，3页)。