舒筋通络外用颗粒质量标准的研究(2)
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参见附件(2462KB，4页)。
(1.Sample; 2.Radix Angelicae Sinensis; 3.Ramulus Cinnamomi; 4.Radix Angelicae Pubescentis; 5.Without Radix Angelicae Sinensis; 6.Without Ramulus Cinnamomi; 7.Without Radix Angelicae Pubescentis)
2.1.2 大黄薄层鉴别
大黄中含有多种蒽醌类成分，具有抗菌、抗感染等作用。考虑大黄素和大黄酚在其他药材中存在，故在含量测定项测定大黄素和大黄酚之前，还要进行大黄的薄层色谱鉴别，用大黄对照药材作为对照，与其他含有大黄素和大黄酚的药材进行区别。
2.1.2.1 供试品溶液的制备取“2.1.1.1”项下的洗液用1 mol/L盐酸溶液调节pH值至1～2，用乙醚提取3次，每次20 ml，合并提取液，挥干，残渣加无水乙醇5 ml使溶解，作为供试品溶液。
2.1.2.2 大黄对照药材溶液的制备取大黄对照药材0.1 g，加乙醚30 ml，超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。
2.1.2.3 大黄阴性对照溶液的制备按处方比例及制法，制成不含大黄的阴性样品，取3 g，按“2.1.2.1”项下方法制成大黄阴性对照溶液。
2.1.2.4 薄层层析照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检识。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光主斑点。阴性对照色谱在相应位置上无干扰，可作为大黄的薄层色谱鉴别，结果见图2。
因当归、桂枝、独活的色谱成分对大黄的薄层色谱鉴别有干扰，故先将大黄的蒽醌类成分用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液分离出来，酸化后再用乙醚进行提取。
2.2 含量测定
本品处方由13味中药组成，其中以大黄为主药，大黄素和大黄酚是其主要有效成分，故选作含量测定指标。正文参照《中国药典》2005年版及2000年版一部“大黄”项下收载的含量测定方法，采用HPLC法测定两者的总量，试验结果如下：
2.2.1色谱条件
色谱柱：大连依利特Hypersil ODS-2(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；检测波长：254 nm；流速：1.0 ml/min。柱温：30℃。
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含大黄素10 μg、大黄酚25 μg的混合溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备
取本品，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并置入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性溶液的制备
取按处方比例及制法制备的缺大黄阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，即得。
2.2.5 测定波长的选择
分别取大黄素和大黄酚对照品溶液，在200～500 nm波长范围内扫描，结果大黄素在221、254、265、290、437 nm，大黄酚在204、225、256、278、287、429 nm波长处有最大吸收，两者均在(254±2)nm波长处有最大吸收，为了同时测定大黄素和大黄酚的含量，故选择测定波长为254 nm，与《中国药典》2000年版及2005年版一部“大黄”含量测定项下测定波长相同。
2.2.6 系统适用性
分别取对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照品溶液，按上述色谱条件进行试验，考察系统适用性。HPLC色谱图见图3。结果表明阴性对照品溶液对测定没有干扰。
图 3 HPLC色谱图
(A.阴性对照；B.供试品；C.混合对照品)
Fig.3 HPLC chromatography
(A.Negative control; B.Sample; C.Reference substance)
2.2.7 线性关系考察
2.2.7.1 大黄素分别精密吸取每毫升含大黄素1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg的大黄素对照品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱峰面积，测得峰面积分别为37.25、73.35、185.51、372.17、744.59、1 868.63。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程，结果表明，大黄素在0.010 0～0.500 0 μg范围内，呈良好的线性关系。回归方程为Y=3 738.66X-1.420 8(r=0.999 9)。
2.2.7.2 大黄酚分别精密吸取每毫升含大黄酚2.50、5.00、12.50、25.00、50.00、125.00 μg的大黄酚对照品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱峰面积，测得峰面积分别为129.37、259.09、649.07、1 325.46、2 636.84、6 388.43。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程，结果表明，大黄素在0.025 0～1.250 0 μg范围内，呈良好的线性关系。回归方程为Y=511 1.80X-23.717 7(r=0.999 9)。
2.2.8 精密度试验
精密吸取大黄素(10.00 μg/ml)、大黄酚(25.00 μg/ml)混合对照品溶液10 μl，重复进样6次，按上述色谱条件测定色谱峰面积，结果表明本法精密度良好。见表1。
表1 精密度试验(n=6)
Tab.1 Precision test (n=6)
2.2.9 重复性试验
取同一批样品(批号：050701)，按“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别测定色谱峰面积，结果表明本法重复性良好。见表2。
表 2 重复性试验(n=6)
Tab.2 Repeatability test (n=6)
2.2.10 稳定性试验
取“2.2.3”项下供试品溶液，分别于放置0、1、2、3、4、24 h后，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。见表3 ......
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