探讨MG132对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其机制(2)
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参见附件(2512KB，3页)。
将传代后细胞接种于培养瓶内，处理同方法“1.2”所述。培养24 h后收集细胞，应用胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白，测蛋白后分装，保存于-80℃冰箱中备用。将等量蛋白以10%聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，半干转法至NC膜上，随后经5%脱脂奶粉封闭，室温下1 h，加入稀释的一抗Bcl-2(1∶300)和Bad(1∶300)，4℃条件下过夜。第2日晨复温30 min，常规方法洗膜，NBT/BCIP显色，双蒸水洗膜终止反应。应用图像处理仪(Gene Company)扫描结果，Image J软件进行半定量分析。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率
细胞传代后接种于6孔板，处理方法同“1.2”所述。培养24 h，吸尽培养基，用胰蛋白酶(0.25%)消化细胞后收集，磷酸盐缓冲液(PBS)液洗2次，每组细胞收集为1管，每管加入凋亡试剂盒中的结合缓冲液将细胞重悬，随后将细胞转移到试管中。每管再分别加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC。避光，室温放置5 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，Sigma Plot 2000作图。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用最小显著差(LSD-t)法，以P<0.05为差异有统计学意义。每组数据至少从3次独立的实验中获得。
2 结果
2.1 MG132对A549细胞成活率的影响
MTT法检测结果显示，随着MG132浓度的增加A549细胞存活率逐渐下降(表1)，呈现浓度依赖性关系。并且，与正常对照组比较，除了0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义(均P<0.05)。
表1 MG132对A549细胞存活率的影响(n=5)
注：与空白对照组比较，*P<0.05
2.2 MG132对A549细胞凋亡率的影响
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示，空白对照组A549细胞凋亡率约(4.0±1.4)%，0 μmol/L组凋亡率为(4.1±1.7)%、5 μmol/L组凋亡率为(12.2±2.1)%、10 μmol/L组凋亡率为(26.3±2.9)%、20 μmol/L组凋亡率为(33.1±3.0)%、40 μmol/L组凋亡率为(54.2±4.7)%，与空白对照组比，除0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义(均P<0.05)。
2.3 MG132对A549细胞中Bcl-2和Bad蛋白的影响
Western Blot结果显示，随着MG132的浓度增高A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低(图1A)，除0 μmol/L组外，其余各组与空白对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。而促凋亡蛋白Bad的表达在各组中无明显变化(图1B)。与空白对照组比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。
A代表Bcl-2在各组中的表达，B代表Bad在各组中的表达；与空白对照组比，*P<0.05，与空白对照组比，#P>0.05
图1 Western Blot检测细胞内Bcl-2和Bad蛋白的表达
3 讨论
泛素-蛋白酶体通路[7](UPP)调控着真核生物细胞内绝大部分蛋白质的降解过程，参与细胞转录、蛋白质稳定、蛋白质降解、细胞凋亡、应激反应和受体胞吞等多种生理过程，能够通过多种途径影响细胞周期的进行，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统。MG132[8](Z-Leu-Leu-Leu-CHO，三肽基乙醛)可以抑制UPP途径介导的蛋白质降解，是一种常用的肽醛类26S蛋白酶体抑制剂，如影响NF-κB、调节细胞内凋亡信号通路、调节细胞周期相关蛋白和凋亡调控蛋白等过程，从而抑制细胞的增殖促进细胞凋亡，是很有发展前途的抗肿瘤药物。也有研究表明：与凋亡调控相关的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均与UPP有关[9-10]。在本研究中笔者特别关注Bcl-2家族在UPP通路中的作用，在细胞凋亡调控机制方面，Bcl-2是迄今研究最广泛而深入的凋亡调控基因之一，在细胞凋亡中起着非常重要的作用，Bcl-2能够抑制细胞凋亡，而Bad则促进细胞的凋亡，是该家族中两组作用相反的蛋白。本研究应用体外培养的A549人肺腺癌细胞，给予不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132处理一段时间后，检测细胞凋亡率的变化，同时观察对细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白表达水平的影响，初步探讨在A549细胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的机制。
该研究结果显示，随着MG132浓度增加A549细胞的凋亡率逐渐增加，并且细胞中Bcl-2蛋白的表达水平也逐渐降低。同时在笔者的实验中也发现，Bad蛋白的表达水平在各组中没有明显变化。因此，笔者推测，MG132可能是通过减少Bcl-2蛋白的表达诱导A549细胞凋亡，而Bad蛋白似乎不参与MG132诱导A549细胞凋亡的作用。Pigneux 等[11]发现MG132 能够明显地增强一种抗肿瘤药物(IDA)诱导白血病细胞的凋亡， 而此作用是通过上调促凋亡蛋白Bim和Bax的表达实现。Yan等[12]观察到MG132 处理的MG-63细胞内除了Caspase-8活性增加、p27聚集外，Bcl-2和Bax比值也明显增加， 说明Bcl-2家族蛋白之间的比例失衡可能也是MG132诱导细胞凋亡的机制之一。Guzman等[13]发现MG132能够诱导人白血病细胞的凋亡， 而对正常的白细胞几乎没有作用。MG132与目前大多数的抗肿瘤药物对细胞无选择性的杀伤作用有明显的不同，因此笔者设想，蛋白酶体抑制剂的应用为肿瘤的治疗提供了新的方向 ......
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