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编号:12192358
熊胆粉微生物限度检查方法学验证(2)
http://www.100md.com 2012年2月5日 杨务彬 李元宏 兰鸿
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    参见附件。

     2.3.3 供试液本底测定

    2.3.3.1 常规法 分别取1∶10供试液1 mL入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养,观察并计数。

    2.3.3.2 培养基稀释法1 分别取1∶10供试液0.2、0.1 mL入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养,观察并计数。

    2.3.3.3 培养基稀释法2 分别取1∶20供试液0.1 mL入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养,观察并计数。

    2.4 回收率测定

    2.4.1 常规法测定

    常规法测定回收率,白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌回收率均高于70%,可采用常规法进行霉菌、酵母菌计数;金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率低于70%,说明本品对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用,细菌检查不能采用常规法。见表1。

    2.4.2 培养基稀释法测定

    2.4.2.1 培养基稀释法(1∶10供试液,0.2 mL/皿)测定回收率 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌回收率高于70%,枯草芽孢杆菌回收率低于70%;采用培养基稀释法(1∶10供试液,0.2 mL/皿)不可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。见表1。

    2.4.2.2 培养基稀释法(1∶10供试液,0.1 mL/皿)测定回收率 枯草芽孢杆菌回收率低于70%;采用培养基稀释法(用1∶10供试液,0.1 mL/皿)不可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。

    2.4.2.3 培养基稀释法(1∶20供试液,0.1 mL/皿)测定回收率 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3次独立试验回收率均高于70%;采用培养基稀释法(1∶20供试液,0.1 mL/皿)可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。见表1。

    2.5 控制菌检查法验证[5-6]

    2.5.1 大肠埃希菌检查法

    分别取1∶10供试液10 mL,加入3瓶100 mL胆盐乳糖培养基中,其中一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液(50~100个/mL)作为试验组,一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液(50~100个/mL)作为阴性菌对照组;另取1瓶100 mL胆盐乳糖培养基,加入1 mL大肠埃希菌菌液(50~100个/mL)作为大肠埃希菌阳性对照组。按大肠埃希菌检查法检验,结果见表2。

    由表2可知,阴性菌对照组未检出大肠埃希菌,试验组检出大肠埃希菌。可采用常规法进行本品的大肠埃希菌检查。2.5.2 金黄色葡萄球菌检查法

    分别取1∶10供试液10 mL,加入3瓶100 mL营养肉汤培养基中,其中一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液(50~100个/mL)作为试验组,一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液(50~100个/mL)作为阴性菌对照组;另取100 mL营养肉汤培养基,加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液(50~100个/mL)作为金黄色葡萄球菌阳性对照组。按金黄色葡萄球菌检查法检验,结果见表3。

    表3 金黄色葡萄球菌检查结果

    由表3可知,阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌,试验组检出金黄色葡萄球菌。可采用常规法进行本品的金黄色葡萄球菌检查。

    2.5.3 铜绿假单胞菌检查法

    分别取1∶10供试液10 mL,加入3瓶100 mL胆盐乳糖培养基中,其中一瓶加入1 mL铜绿假单胞菌菌液(50~100个/mL)作为试验组,一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液(50~100个/mL)作为阴性菌对照组;另取一瓶100 mL胆盐乳糖培养基,加入1 mL铜绿假单胞菌菌液(50~100个/mL)作为铜绿假单胞菌阳性对照组。按铜绿假单胞菌检查法检验,结果见表4。

    由表4可知,阴性菌对照组未检出铜绿假单胞菌,试验组检出铜绿假单胞菌。可采用常规法进行本品的铜绿假单胞菌检查。

    2.5.4 大肠菌群检查法

    分别取1﹕10供试液1 mL,加入3管10 mL胆盐乳糖发酵管中,其中一管加入1 mL大肠埃希菌菌液(50~100个/mL)作为试验组,一管加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液(50~100个/mL)作为阴性菌对照组;另取1管10 mL胆盐乳糖发酵管,加入1 mL大肠埃希菌菌液(50~100个/mL)作为大肠菌群阳性对照组。按大肠菌群检查法检验,结果见表5。

    表5 大肠菌群检查结果

    由表5可知,阴性菌对照组未检出大肠菌群,试验组检出大肠菌群。可采用常规法进行本品的大肠菌群检查。

    2.5.5 沙门菌检查法

    分别取本品10 g,加入3瓶200 mL营养肉汤中,其中一瓶加入1 mL沙门菌菌液(50~100个/mL)作为试验组,一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液(50~100个/mL)作为阴性菌对照组;另取1瓶200 mL营养肉汤,加入1 mL沙门菌菌液(50~100个/mL)作为沙门菌阳性对照组,按沙门菌检查法检查。结果提示,阴性菌对照组未检出沙门菌,试验组未检出沙门菌,但沙门菌阳性对照组检出沙门菌,故不能采用常规法进行本品的沙门菌检查。所以沙门菌检查法调整为:分别取本品10 g,加入3瓶400 mL营养肉汤中,其中一瓶加入1 mL沙门菌菌液(50~100个/mL)作为试验组,一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液(50~100个/mL)作为阴性菌对照组;另取1瓶400 mL营养肉汤,加入1 mL沙门菌菌液(50~100个/mL)作为沙门菌阳性对照组。按沙门菌检查法检验,结果见表6。

    表6 沙门菌检查结果

    由表6可知,阴性对照组未检出沙门菌,试验组检出沙门菌。可采用培养基稀释法进行本品的沙门菌检查。

    3 讨论

    本品按《中国药典》2010年版一部(附录ⅩⅢC)微生物限度检查法进行方法验证,结果表明,用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品,可采用培养基稀释法(1∶20供试液 ......

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