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编号:12706548
不同时期增生性瘢痕组织中前列腺素和基质金属蛋白酶—2的含量测定及分析(2)
http://www.100md.com 2014年12月5日 袁志坚 周梅芳 何文涓 吴华英 赵庆国
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    参见附件。

     1.3 实验方法

    1.3.1 不同时期瘢痕组织中PGs含量的检测 本实验测的PGs包括PGD2,PGE2和PGF2α,均用试剂盒检测。PGD2的具体检测过程如下:取冻存的组织标本,按组织质量与PBS体积比为1 mg∶5 μL比例混合后,用玻璃匀浆器研磨成组织匀浆,然后用离心机以3000 r/min的转速离心10 min,分离上清液,即得待测样品。然后按试剂盒说明书操作:①向标准品孔中每孔加入标准品50 μL,并做好标记。② 向待测样品每孔加入50 μL待测样品,并做好标记。③标准品孔和待测样品孔分别加入25 μL酶标志物,充分混匀。④将包被微孔板加盖后放置于37℃孵箱中孵育60 min,充分弃尽孔内液体,用预先稀释好的清洗液反复冲洗5次。以防孔内液体溢出污染其他实验孔。⑤向包括空白对照孔在内的所有孔,依次加入底物Ⅰ50 μL(HRP-avidin),再加入底物Ⅱ50 μL(TMB),室温下避光反应15 min。⑥ 反应过后每孔加入终止液(2 mol/L硫酸)50 μL,充分混匀,终止反应。⑦30 min内使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度值,根据标准曲线计算PGE2的浓度。PGE2和PGF2α的检测方法也按试剂盒说明书检测。

    1.3.2 不同时期瘢痕组织中MMP-2蛋白的测定 采用Western bolt法。每组中取3例患者的瘢痕组织进行MMP-2蛋白含量测定,瘢痕皮肤组织按1 mg∶5 μL的比例加入含有(浓度为1 mmol/L)RIPA裂解液。冰浴条件下用玻璃匀浆器破碎组织。充分裂解后用离心机以12 000 r/min的转速离心5 min。分离上清液即为总蛋白提取液。取40 μg蛋白进行SDS-PAGE进行电泳,凝胶经半干电转仪转膜,转移好的纤维棉漂洗后,将膜置于封闭液中,防止变干 ......

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