高效液相色谱/质谱联用法测定银黄颗粒中绿原酸含量
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摘 要：目的：建立高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC/ESI/MS)联用测定银黄颗粒中绿原酸含量。方法：以质谱定性，高效液相色谱定量进行检测，检测波长327nm。所用的色谱柱为Spherigel C18色谱柱(200 × 4.6 mm，5m)流动相为乙腈-0.4%磷酸水。结果：在该色谱条件下，绿原酸的含量在1.56g/mL~25g/mL范围内线性关系良好，相关系数为：r=0.9992，加样回收率为99.7%，RSD为2.63%(n=5)，最低检出限为0.05g/mL。结论：该方法操作简单，分离度好，适用于银黄颗粒及其提取物中绿原酸含量的测定。
关键词：高效液相色谱/质谱法(HPLC/MS)；绿原酸；银黄颗粒
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-038-03
银黄颗粒是由金银花、黄芩两味药材加工制成的复方制剂，具有清热、解毒、消炎的功效[1]，主要用于急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎、上呼吸道感染等症。金银花(Flos lonicerae)为忍冬科(Caprifoaceae)忍冬属(Lonicera)植物，是本方的主药之一[2]。金银花的活性成分之一为绿原酸(结构式如图1)。绿原酸为咖啡酰奎尼酸衍生物，由奎尼酸和咖啡酸缩合而成，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性溶剂，是一种重要的生理活性物质。绿原酸为抗菌消炎的主要成分，对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾球菌、伤寒杆菌、肺炎球菌有显著的抑制作用；有抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等作用；与人体血小板凝集和凝血因子的生成有关，还具有抗生育作用及对免疫系统的调节作用[3，4]。
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银黄颗粒中主药金银花的有效成分绿原酸的含量测定主要采用高效液相色谱法[5，6]，本文采用高效液相色谱/质谱联用法，对银黄颗粒中绿原酸的含量进行测定。以期提高银黄颗粒质量标准可控性，为进一步完善该制剂的质量标准提供实验依据。
图1 绿原酸结构式
1 仪器与试药
1.1 仪器
液相色谱-质谱联用仪：Waters 2695-Micromass ZQ 2000质谱检测器(含四元低压泵、自动进样器、单级四极杆质谱检测器、Masslynx工作站、电喷雾电离源ESI)；KQ 3200 B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 材料与试剂
银黄颗粒(河北省某厂生产)；绿原酸标准品(购自中国药品生物制品检定所)；甲醇，丙酮，无水乙醇，磷酸均为分析醇，乙腈为色谱纯；二次蒸馏水。
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2 方法与结果
2.1 液相色谱条件
色谱条件：色谱柱Spherigel C18 色谱柱(200×4.6mm，5m)(大连江申分离科学科技公司)，流动相：乙腈-0.4%磷酸水，梯度程序见表1。检测波长327nm，进样量10L；流速：1mL/min。
2.2 质谱条件
质谱条件：用电喷雾离子化负离子采集模式(ESI-)，m/z范围：60～800m/z，毛细管电压：3.2kV，锥孔电压：20V，萃取电压：4V，射频电压：0.5V，源温度：102℃，脱溶剂温度：300℃，脱溶剂气流速：280L/h；锥孔反吹气流速：60L/h；由DAD流出的溶液经过三通阀分流，以0.2ml/min进入到MS电离源。
2.3 对照品溶液制备
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精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥10h以上的绿原酸对照品2.5mg，置50ml棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(绿原酸含量50g/ml)。
2.4 供试品溶液的制备
用碾钵将银黄颗粒磨成细小粉末，精确取0.5416g样品，置50ml棕色容量瓶中，加50%甲醇适量，超声提取30min使溶解，放冷至室温，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.5 线性范围和检测限
分别取50g/mL绿原酸标准品用甲醇配制成，12.5g/mL，6.25g/mL，3.13g/mL，1.56g/mL的系列标准品，过0.45m膜后，按2.1色谱条件每个浓度的标准品进样3次，记录峰面积。以浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标得到绿原酸的标准曲线方程为：
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y=725.42x-268.21，线性范围：1.56g/mL~25g/mL，相关系数r=0.9992
将绿原酸标准溶液逐级稀释后，测得最低检测限为0.05μg/mL(S/N=3)；最低定量限为0.2μg/mL(S/N=10)。
2.6 HPLC/ESI/MS分析
绿原酸的分子式为C16H18O9，相对分子质量为354.30。按2.1色谱条件，得到了对照品和银黄颗粒样品色谱图(图2)，绿原酸的相对保留时间为9.78min左右。图3为选择离子m/z353质谱图。
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图2 HPLC色谱
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a.对照品色谱图；b.银黄颗粒样品色谱图
a
b
图3 质谱
a.绿原酸对照品质谱图；b.银黄颗粒样品质谱图
m/z 353是绿原酸分子失氢后形成的准分子离子[M-H]-，m/z708为二聚物脱氢形成的碎片离子，m/z191为酯键断裂脱去咖啡酰基生成[M-caffeoyl]-碎片离子，这些推测结果与谱图上所反映的信息基本一致。随着锥孔电压升高，总离子流响增强，分子离子峰的强度降低，当电压升到20V时，准分子离子峰强度最强。所以在选择离子模式中，锥孔电压设为20V。
2.7 精密度和回收率试验
取25g/mL绿原酸标准溶液，按2.1色谱条件连续进样6次，每次进样10L，以峰面积计算相对标准偏差，结果为RSD=1.44%(n=6)。
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取5份已知含量的银黄颗粒样品0.5g左右，精密称定，分别加入50g/mL标准品1.00mL，按样品处理的方法，以50%甲醇超声提取30min，过滤，过膜，按2.1色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，得平均回收率为99.7%，RSD为2.63%(n=5)。
2.8 重复性试验
取银黄颗粒样品0.5g左右6份，精密称定，以50%甲醇超声提取30min，过滤，过膜，按2.1色谱条件测定峰面积，计算各组分绿原酸含量，结果RSD=2.12%(n=6)，表明重复性好。
2.9 样品分析
取2.4制备的待测液过0.45m膜后，按2.1色谱条件进样测定，平行进样5次，积分求峰面积，根据回归方程，求得到绿原酸的平均含量为5.13mg/g。
2.10 提取条件的选择
分别加入40%、50%、70%甲醇，50%、70%丙酮，40%、50%、70%乙醇，冷水和热水，分别定容至50mL，超声30min，过0.45m膜，备用进样。不同溶剂提取的绿原酸含量(见表2)，由表可知，40%甲醇的提取效果最好，而绿原酸在水中的溶解度低，水提取的效率较低。
比较乙醇与甲醇提取效果，当乙醇浓度达到70%时，提取率跟40%甲醇接近。考虑到甲醇的成本和毒性，实验可以选取70%乙醇进行超声提取。虽然绿原酸易溶于丙酮，70%丙酮和50%丙酮提取的样品含量与甲醇提取的样品结果相近，说明丙酮提取方法可行。但由于丙酮的微毒性、直接进样丙酮的溶剂峰干扰较大，蒸干后再溶解进样操作复杂，因此不宜使用丙酮作为提取溶剂。, http://www.100md.com(丁芳林 彭书练)