眼刺激性体外评价方法研究进展(2)
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盐变性以外的因素引起的眼刺激性。
2.3 基于鸡胚尿囊绒膜试验(Chorioallantoic Membrane-based Assays)
受精鸡卵尿囊绒膜试验(Hen's egg test-ehorioallantoic-membrane，HET-CAM)利用尿囊绒膜(CAM)与结膜结构相似的特点，通过以下两种方法检测化学物对CAM的损伤来评价其眼刺激性。显微镜观察法(HET-CAM score)是用解剖显微镜观察经化学物作用后不同时间段CAM血管的损伤情况，以出现溶血(hemolysis)、出血(haemorrhage)和凝血(coagulation)作为指标进行评分。台盼蓝染色法(CAM-TB)是通过分光光度计测定经化学物处理后CAM吸收的台盼蓝量来评价CAM的损伤。
用CAM方法评估特定种类化学品眼刺激性的试验都显示较满意结果。CAM试验能很好预测角膜混浊和虹膜炎症；比较而言，HET-CAM分析表面活性剂类产品的效果较好，CAMVA分析醇类效果较好。运用该种方法每天可以检测大量受试物，且不需要特殊仪器，有快速、灵敏、简单和价廉的优点。由于使用的是孵育第10天的鸡卵，CAM上没有神经支配，避免了对鸡胚造成的痛苦并可减少动物的使用量，符合“3R”精神。
2.4 离体器官试验(The Enueleated Eye Test)
离体眼球试验(The Enucleated Eye Test简称EET)是一种非常有价值的眼刺激性评价方法。该方法使用离体眼球，其试验系统非常接近体内试验，无需活体动物。该试验通过检测角膜水肿、混浊及荧光素滞留，并进行组织学观察评估受试物的眼刺激性。在这些测定指标中，角膜水肿客观性和区分不同刺激性物质的敏感度都较高，再辅以浑浊度和荧光素滞留量两指标，形成了一种具有相当说服力的评价眼刺激性的试验方法。包括离体兔眼、猪眼、鸡眼等试验模型，现在主要作为一种评价各种产品及其成分、个体化合物等是否对眼部具有腐蚀性和严重刺激性的筛选方法。该法也可作为体外联合评价试验的筛选方法之一。
2.5 细胞试验(Cell Cultrue)
细胞毒性试验通过检测培养细胞对染料或其代谢产物的摄取、还原、排斥、释放及炎性介质漏出等变化，反映受试物对细胞结构及存活力的影响。采用该研究思路，国外建立了多种细胞模型，采用检测多种指标评价物质潜在的刺激性，检测的指标主要包括细胞增殖、膜完整性和细胞活性。兔眼角膜上皮细胞就是较早用于该领域的细胞模型，主要通过LDH和MTT两种方法进行检测评价。O.Doucet等利用人眼角膜细胞建立三维上皮模型，以细胞毒性反应为终点，结果发现检测结果与动物试验结果具有良好的相关性。检测终点也发展到对一些微观指标的测定，如细胞因子含量等，例如Debbasch等发现以IL-8释放为终点的人类角膜上皮细胞毒性试验是一种敏感而可靠的预测人类轻微眼刺激性产品的方法。
2.6 商业试剂盒
采用兔角膜上皮细胞毒性试验作为评价方法而建立的CornePack试剂盒，具有灵敏度高、可应用于有色物质的估测等优点，但是与其它细胞毒性方法相比，对不溶物质检测，其重现性不好，而且与体内试验的相关性较差。Gor-don和Bergman采用分光光度计测定合成蛋白质基质中的浑浊度来估测受试物对眼的刺激性，建立了EYTEX试验系统。将人的鳞状上皮细胞和基质纤维细胞共同培养在尼龙表面，形成有气液表面的上皮层原型而建立的SKIN2TMZK1200试剂盒，其结构类似于眼角膜和结膜。Kurishita等用此模型验证了39种化妆品成分的刺激性，发现相关性较好(r＝0.71)。
2.7 其它
Adriaens.E等使用蛞蝓黏膜刺激性试验(SlugMucosal Irritation assay SMI)作为筛选眼刺激性的试验方法，该法通过检测蛞蝓粘膜表面暴露于受试物以后的蛋白质变化和酶的释放评价刺激性，可以检测出热和烧灼感的影响，这是其它体外方法无法实现的。研究表明，该试验是一种有希望的筛选眼刺激性物质的评价方法，但耗时较长，不适合大批量的筛选试验。
3 结论与展望
现阶段提出的一些体外试验方法虽然在一定程度上能够反应出其对眼部的刺激性，但是每种方法都有其各自的缺点，没有一种方法能像Draize test一样具有多功能、多指标的试验结果，所以几乎没有一种方法能够被官方所认可接受用以替代Draize test。
当今国际上流行的化学物眼刺激检测策略有两种：多层试验(TIERED TEST)和同步联合试验(BATTERY TEST)。多层试验又称逐步检测策略，即通过文献资料、理化性质等对化学物的刺激性预先估测，然后进行体外试验即替代试验，对不能确定刺激效应的物质才进行少量动物的确定性试验 ......
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