Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建
Red蛋白,核定位信号,同源重组系统,蛋白质表达
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张晓楠 黄勇 曹蔚 侯颖 赵玮钦 关璐媛 陈苏民 吴元明 第四军医大学药理教研室;西北工业大学生命科学院;第四军医大学生物化学与分子生物学教研室;第四军医大学病理与生理学教研室;
【摘要】目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论:三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。
【关键词】 Red蛋白 核定位信号 同源重组系统 蛋白质表达
【基金】国家自然科学基金资助项目(No.3017522)
【分类号】Q786
前言λ噬菌体的Red系统是个独特的、高效率的同源重组基因,在原核生物的研究领域,来源于λ噬菌体的Red重组系统已成功地应用于基因的定点替代、修复和染色体工程中[1],Red重组系统由G am、Bet、Exo三种蛋白组成。其中G am能抑制宿主细胞中核酸酶活性,从而保护替代靶基因的线
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摘要 目的：构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法：通过给red基因(gam、bet和exo)的3，端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal，NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列，再从λ噬菌体基因纽中，通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列，将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中，得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN，转染培养的哺乳类细胞后，用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测，观察蛋白的定位情况。结果：不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核；而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后，均表达定位于细胞核中。结论：三顺反子表达载体pcMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。
关键词：Red蛋白；核定位信号；同源重组系统；蛋白质表达
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1673-6273(2008)10-1809-04
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