Smad4基因siRNA表达载体的构建与鉴定
RNA干扰,基因克隆,成纤维细胞,转化生长因子β
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何云武 张彩平 龙石银 王思远 崔慧辉 雷小勇 南华大学生命科学与技术学院药物药理研究所;南华大学附二医院;南华大学生物技术系;
【摘要】目的:以Smad4基因为靶标构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体。方法:根据GenBank公布的人Smad4核酸序列及SiRNA设计原则,用AmbionRNAi在线软件,筛选得到2个19bp片段为靶序列,合成两端带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆到真核表达质粒pSilencerTM3.1-H1neovector中,构建成重组质粒,酶切及测序验证。脂质体介导转染人原代增生性瘢痕成纤维细胞,经G418筛选细胞克隆,并用RT-PCR检测Smad4基因的表达。结果:成功构建了pSilencerTM3.1-H1neo-Smad4shRNA表达载体克隆,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致。RT-PCR结果显示转染shRNA1、shRNA2重组质粒的成纤维细胞内Smad4 mRNA水平均降低,其中以pSilencerTM3.1-H1-Smad4 shRNA1更为明显(P0.01)。结论:构建p-Smad4 shRNA表达载体成功,为进一步研究Smad4基因的RNA干扰奠定了基础。
【关键词】 RNA干扰 Smad 基因克隆 成纤维细胞 转化生长因子β
【基金】湖南省卫生厅中医药局科研基金(No:06103-22) 湖南省教育厅青年基金(No:08B065)
【分类号】Q78
TGF-β/Smads信号转导通路是由TGF-β超家族、TGF-β受体、Smads蛋白家族及其核内转录调节因子组成的,其中,Smad4是TGF-β抗增殖效应的核心分子,活化的R-Smads与Smad4结合成寡聚物,可将TGF-β的信号转导至核内,调节靶基因的转录并诱导下游基因的表达[1-3]。RNA干扰(RNAi)技术
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TGF-β/Smads信号转导通路是由TGF-β超家族、TGF-β受体、Smads蛋白家族及其核内转录调节因子组成的，其中，Smad4是TGF-β抗增殖效应的核心分子，活化的R-Smads与smad4结合成寡聚物，可将TGF-β的信号转导至核内，调节靶基因的转录并诱导下游基因的表达。RNA干扰(RNAi)技术是将与靶基因同源的小片段RNA(siRNA)转染相应细胞，特异性诱导靶基因mRNA降解，从而研究目的基因功能。本研究选择pSilence3.1-H1 neo作为小分子干扰RNA(siRNA)的表达载体，设计并构建针对人Smad4基因的小发夹RNA(shRNA)表达载体，为后期研究smad4基因在纤维化疾病、肿瘤发生中的作用机制和基因治疗的可行性奠定基础。
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