肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建
钙调蛋白,激酶活性,胃平滑肌,大肠杆菌中表达,感受态细胞,定点突变,分离纯化
 |
| 第1页 |
参见附件(2018KB，4页)。
魏晓晴 张月 赵莹 吕广艳 崔颖 王辉 高颖 辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室;大连医科大学生化教研室;
【摘要】目的:平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用。为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,本实验利用分子生物学技术构建了肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体,并纯化出重组的MLCK表达的蛋白质,为深入研究MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制提供了实验基础。方法:利用野生型MLCK全长的cDNA序列设计CaM结合位点的突变引物,利用PCR技术进行定点突变,获得CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK)。在大肠杆菌中表达重组CaM结合位点的突变体(△CaM/MLCK),通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白。结果:构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK),△CaM/MLCK在大肠杆菌中以可溶形式大量表达并得到纯化。结论:成功构建重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)并获得纯化的表达蛋白质。
【关键词】 肌球蛋白轻链激酶 钙调蛋白 突变体 结合位点 激酶活性 胃平滑肌 大肠杆菌中表达 感受态细胞 定点突变 分离纯化
【基金】国家自然科学基金资助项目(30470394)
【分类号】Q55
前言肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)是平滑肌收缩机制中的关键酶,MLCK作为一种多功能调节蛋白,除具有在Ca2+/CaM存在情况下磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链,从而引起平滑肌收缩的激酶活性外,还具有与肌球蛋白和肌动蛋白结合的非激酶活性[1]。虽然MLCK的激酶活
------
前言
肌球蛋白轻链激酶(myosin light chai nkinase，MLCK)是平滑肌收缩机制中的关键酶，MLCK作为一种多功能调节蛋白，除具有在Ca2+CaM存在情况下磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链，从而引起平滑肌收缩的激酶活性外，还具有与肌球蛋白和肌动蛋白结合的非激酶活性。虽然MLCK的激酶活性在平滑肌收缩中起主要的调节作用，但有研究发现其非激酶活性也同样具有调节作用，为了研究MLCK的非激酶活性，本实验对牛胃重组全长MLCK的]002-1022位氨基酸的CaM结合位点(1002-1022CaM结合位点)进行定点突变，获得重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)，为探讨MLCK的功能提供有力的实验基础。
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2018KB，4页)。