DNA甲基转移酶RNAi干涉载体的构建及其鉴定
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王志伟 于小青 郭兴东 邝美华 余龙江 栗茂腾 付春华 华中科技大学生命科学与技术学院资源生物学与生物技术研究所;
【摘要】DNA甲基化(DNA Methylation)是真核生物基因组最常见的DNA共价修饰形式,影响蛋白质-DNA的相互作用,在基因表达的调控上起着重要作用。RNAi(RNA interference)干涉是关闭特定基因功能的新技术,在植物功能基因组、植物发育及生理代谢途径调控等方面有着广泛应用。本文根据植物DNA甲基转移酶(DNMTs)的保守序列设计引物,首先从拟南芥总基因组DNA中克隆出DNA甲基转移酶基因保守片段,然后以此保守片段为模板扩增长度约570bp的靶序列用于构建RNAi载体。根据RNAi作用机制,将570bp靶序列正向、反向连接到pHANNIBAL载体上,然后将带有此反向重复结构的完整ORF框连接到植物表达载体pGreeII上,经过酶切鉴定和测序分析证实DNA甲基转移酶RNAi重组表达载体构建成功。转化红豆杉细胞表明该干涉载体具有生物学功能,为研究受DNA甲基化调控的性状改良打下基础。
【关键词】 DNA甲基化转移酶 RNAi 载体构建
【基金】国家自然科学基金资助(200906036和20776058)
【分类号】R341
前言DNA甲基化(DNA Methylation)是真核生物基因组最常见的DNA共价修饰形式,影响蛋白质-DNA的相互作用,在基因表达的调控上起着重要作用。它主要发生在5'-CpG-3'双核苷酸序列中的胞嘧啶上,是在DNA甲基转移酶(DNA methy-transferases,DNMTs)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供
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前言
DNA甲基化(DNA Methylation)是真核生物基因组最常见的DNA共价修饰形式，影响蛋白质-DNA的相互作用，在基因表达的调控上起着重要作用。它主要发生在5'-CpG-3’双核苷酸序列中的胞嘧啶上，是在DNA甲基转移酶(DNA methy-transfcrases，DNMTs)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶碱基上，生成5-甲基胞嘧啶，从而对DNA进行修饰的过程。在生物组织培养过程中，DNA甲基化水平会发生变化，导致生物性状发生变化。近年的研究显示，DNA甲基化水平与细胞中代谢产物的合成有很大关系。如夏宁在研究中发现，NO在调节怀槐悬浮培养细胞异黄酮合成时，可调节细胞DNA甲基化水平，异黄酮的生成量与DNA甲基化水平呈负相关，表明DNA甲基化影响植物的次生代谢。
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