核因子κB活性与环氧化酶2在胃癌及胃炎病变中的表达研究(2)
1.4 实验试剂 免疫组化试剂盒，p65单克隆抗体购自北京中山公司，[γ-32P]ATP购于北京福瑞生物工程公司。EMSA试剂盒购于Promega公司。
2 研究方法
2.1 实验方法
2.1.1 核蛋白抽提 从液氮中取出冻存组织，隔铝泊纸捣碎研磨加入裂解缓冲A液(10 mmol/L HEPES-KOH，1.5 mol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT 10 μg/mL Leupeptin，35 μg/mL Aprotinin)312 μl彻底裂解粉末，0℃匀浆10~20次，0℃，2 000 r/min，离心15s，弃沉淀，保留上清液冰浴5 min。0℃，5 000 r/min，离心10s。保留沉淀加入裂解缓冲B液(20 mmol/L HEPES-KOH，25%Glycerol，420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT，10 μg/mL Leupeptin，35 μg/mL Pepstatin，10 μg/mL Aprotinin)104 μl重悬，冰浴20 min，0℃，12 000 g，离心15 min。保留上清液，取100 μl采用考马斯亮蓝染色法测定核蛋白浓度[15]。
, 百拇医药
2.1.2 凝胶迁移滞留试验(EMSA)检测NF-κB DNA结合活性 NF-κB寡核苷酸双链序列：5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC，3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG，采用[γ-32P]ATP进行探针标记，4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(恒电压150v，恒电泳时间40 min)，剥离胶片烤干，磷屏曝光。
2.1.3 免疫组化法(SABC) 检测NF-κB p65、COX-2蛋白表达，检测方法详见参考文献[15]。光学显微镜观察，胞浆和/或胞核染成棕黄色为阳性细胞。然后对DSS和NS两组组织进行评分[16]。评分标准如下：每张片随机取5个视野，每个视野非别进行评分。a为高倍镜下阳性细胞数所占百分率评分(无阳性细胞a=0；阳性细胞数1%~10%a=1；阳性细胞数：11%~50%a=2；阳性细胞数:51%~80%a=3；阳性细胞数:81%~100%a=4)。b阳性细胞染色的强弱评分(阴性b=0；弱阳性b=1；中度阳性b=2；强阳性b=3)。两者的乘积(a×b)即为综合评分。
, 百拇医药
2.2 数据统计方法 计量资料用表示，SPSS10.0统计软件先进行正态性检验及方差齐性检验。两组比较用 t 检验，三组或以上的比较用方差分析。率的比较用卡方检验或确切概率法， P
3.2 NF-κB-p65 在胃癌、癌旁及胃炎组织中的表达情况 NF-κB-p65成份免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒，主要定位于胃癌组织细胞核及胃炎组织细胞胞浆中(见图2及图3)。免疫组化显示NF-κB-p65在胃癌中阳性表达57例，阳性表达率为87.7%，评分为12.69±0.23，癌旁组织中阳性7例，阳性表达率为10.8%，评分为3.56±0.27，胃炎组织中32例，阳性表达率为55.2%，评分为7.28±29。与胃癌组织比较其余两组均具有显著性差异( P
4 讨论
NF-κB最早是从B细胞中发现的一种能与IG κ链基因的增强子特异性结合的核蛋白因子。已发现许多组织细胞及病毒增强子和启动子存在NF-κB的作用位点[3]。NF-κB 的激活受到细胞内网络式信号传导通路的调节[4]。已证明人类的许多炎症性疾病与NF-κB活化相关，包括炎症性肠病、类风湿关节炎、动脉粥样硬化症、多发性硬化、全身炎症反应综合征等[5]。
本研究发现，癌组织的NF-κB-DNA结合活性最高，较癌旁组织和胃炎组结合活性显著增强。提示了国人胃癌患者中，大部分人癌组织中NF-κB表达增多且活性增强，NF-κB可能在胃癌的发生发展起了重要的调控作用。NF-κB有可能成为早期检测胃癌的肿瘤标记物。本研究还发现中高分化和低分化组中NF-κB的阳性表达率无明显差异，不同分化程度的胃癌，NF-κB阳性表达的差别尚未体现出来，可能与NF-κB活化在淋巴细胞分化成熟的不同所致。在胃癌手术治疗中检测病变胃癌组织NF-κB的表达，是否有助于制定合理手术方案，明确手术切除范围，尚需要进一步研究证实。, 百拇医药(杨名诗 陈 垦)
2 研究方法
2.1 实验方法
2.1.1 核蛋白抽提 从液氮中取出冻存组织，隔铝泊纸捣碎研磨加入裂解缓冲A液(10 mmol/L HEPES-KOH，1.5 mol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT 10 μg/mL Leupeptin，35 μg/mL Aprotinin)312 μl彻底裂解粉末，0℃匀浆10~20次，0℃，2 000 r/min，离心15s，弃沉淀，保留上清液冰浴5 min。0℃，5 000 r/min，离心10s。保留沉淀加入裂解缓冲B液(20 mmol/L HEPES-KOH，25%Glycerol，420 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT，10 μg/mL Leupeptin，35 μg/mL Pepstatin，10 μg/mL Aprotinin)104 μl重悬，冰浴20 min，0℃，12 000 g，离心15 min。保留上清液，取100 μl采用考马斯亮蓝染色法测定核蛋白浓度[15]。
, 百拇医药
2.1.2 凝胶迁移滞留试验(EMSA)检测NF-κB DNA结合活性 NF-κB寡核苷酸双链序列：5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC，3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG，采用[γ-32P]ATP进行探针标记，4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(恒电压150v，恒电泳时间40 min)，剥离胶片烤干，磷屏曝光。
2.1.3 免疫组化法(SABC) 检测NF-κB p65、COX-2蛋白表达，检测方法详见参考文献[15]。光学显微镜观察，胞浆和/或胞核染成棕黄色为阳性细胞。然后对DSS和NS两组组织进行评分[16]。评分标准如下：每张片随机取5个视野，每个视野非别进行评分。a为高倍镜下阳性细胞数所占百分率评分(无阳性细胞a=0；阳性细胞数1%~10%a=1；阳性细胞数：11%~50%a=2；阳性细胞数:51%~80%a=3；阳性细胞数:81%~100%a=4)。b阳性细胞染色的强弱评分(阴性b=0；弱阳性b=1；中度阳性b=2；强阳性b=3)。两者的乘积(a×b)即为综合评分。
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2.2 数据统计方法 计量资料用表示，SPSS10.0统计软件先进行正态性检验及方差齐性检验。两组比较用 t 检验，三组或以上的比较用方差分析。率的比较用卡方检验或确切概率法， P
3.2 NF-κB-p65 在胃癌、癌旁及胃炎组织中的表达情况 NF-κB-p65成份免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒，主要定位于胃癌组织细胞核及胃炎组织细胞胞浆中(见图2及图3)。免疫组化显示NF-κB-p65在胃癌中阳性表达57例，阳性表达率为87.7%，评分为12.69±0.23，癌旁组织中阳性7例，阳性表达率为10.8%，评分为3.56±0.27，胃炎组织中32例，阳性表达率为55.2%，评分为7.28±29。与胃癌组织比较其余两组均具有显著性差异( P
4 讨论
NF-κB最早是从B细胞中发现的一种能与IG κ链基因的增强子特异性结合的核蛋白因子。已发现许多组织细胞及病毒增强子和启动子存在NF-κB的作用位点[3]。NF-κB 的激活受到细胞内网络式信号传导通路的调节[4]。已证明人类的许多炎症性疾病与NF-κB活化相关，包括炎症性肠病、类风湿关节炎、动脉粥样硬化症、多发性硬化、全身炎症反应综合征等[5]。
本研究发现，癌组织的NF-κB-DNA结合活性最高，较癌旁组织和胃炎组结合活性显著增强。提示了国人胃癌患者中，大部分人癌组织中NF-κB表达增多且活性增强，NF-κB可能在胃癌的发生发展起了重要的调控作用。NF-κB有可能成为早期检测胃癌的肿瘤标记物。本研究还发现中高分化和低分化组中NF-κB的阳性表达率无明显差异，不同分化程度的胃癌，NF-κB阳性表达的差别尚未体现出来，可能与NF-κB活化在淋巴细胞分化成熟的不同所致。在胃癌手术治疗中检测病变胃癌组织NF-κB的表达，是否有助于制定合理手术方案，明确手术切除范围，尚需要进一步研究证实。, 百拇医药(杨名诗 陈 垦)