肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞对扩心病大鼠心肌纤维化和凋亡的影响(2)
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移植骨髓间充质干细胞(mesencgymalstemcells,MSCs)实验性治疗扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)心力衰竭近年来取得了一定的成效,但还不够理想[1]。MSCs是一类可向心肌等多种细胞谱系分化的干细胞[2],它可能通过旁分泌机制或分化为心肌的方式改善心功能[3]。肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)是一种具有较强的抗纤维化和抗凋亡活性的多功能因子[4]。本实验比较移植人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰的MSCs和未经修饰的MSCs二者对DCM心力衰竭大鼠心功能的影响,并对其主要机制作初步探讨。
1 资料与方法
1.1 材料 50只12周龄清洁级雄性SD大鼠约(200±10)g(上海斯莱克实验动物有限公司);携有人肝细胞生长因子的腺病毒(ad-hHGF)(北京军事医学科学院放射研究所),注射用盐酸阿霉素(国药准字H33021980),兔抗hHGF和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体及二氨基联苯胺显色试剂盒皆购自北京中杉金桥生物有限公司。TUNEL凋亡试剂盒(Roche公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组和心力衰竭模型的建立 50只12周龄清洁级雄性SD大鼠,随机抽取36只制作心衰大鼠模型,将盐酸阿霉素稀释成5mg/mL,腹腔注射2mg/(kg•次),每周1次,连续6周。另外,14只作为对照组,注射氯化钠溶液。建模期间死亡6只,模型成功大鼠(n=30)与对照组(n=14)分别取6只做模型鉴定。剩余心衰大鼠随机分为3组:模型组(n=8),MSCs组(n=8),MSCs-hHGF组(n=8);此外对照组8只。
1.2.2 MSCs的分离培养和纯化 用DMEM培养液对股骨骨髓腔进行反复冲洗,离心后用淋巴细胞分离液提取MSCs,接种于培养瓶中,约3～4d换液1次。原代培养的细胞生长至铺满瓶壁的2/3以上时,即可传代。重复消化传代,本研究以第3代MSCs作为移植治疗细胞。
1.2.3 重组腺病毒Ad-hHGF的扩增和Ad-hHGF体外感染MSCs,待293细胞于培养瓶中生长到90%汇合状态时,感染强度MOI按10个空斑形成单位/细胞的量加入病毒,36~48h后,细胞出现完全的致细胞病变效应(CPE)时,将293细胞于-80℃和37℃间反复冻融3次,离心后收集病毒上清保存于-80℃。将MSCs(约1×106个)37℃培养24h,吸出原培养液,分别加入不同MOI的Ad-GFP,MOI分别为25、50、100、200pfu/细胞,以DMEM作为对照,每瓶加3ml培养液,每24h换一次培养液,当细胞达到80%~90%融合后,用0.125%的胰蛋白酶消化,以DMEM培养基终止反应。
1.2.4 细胞移植 造模成功后,通过尾静脉移植MSCs,MSCs组移植MSCs100μL(约3×106)个/只,MSCs-hHGF组移植MSCs-hHGF100μL(约3×106个),模型组和对照组各注射等量DMEM培养基。
1.2.5 大鼠心功能的评价 移植后4周,经右颈总动脉插入硅胶管,另一端连接压力换能器,接于生理多导记录仪。分别记录左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)。
1.2.6 免疫组织化学分析检测hHGF 严格按照生产商提供的说明书步骤进行二步法操作,其中兔单克隆hHGF抗体用PBS溶液150倍稀释。
1.2.7 天狼星红染色心肌胶原纤维 石蜡切片常规脱腊至水,入0.1%苦味酸天狼星红染液中染色2h,冲洗封片。
1.2.8 TUNEL法即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡 严格按照Roche公司相关说明书进行操作。
1.2.9 统计方法 计量资料用均值±标准差(mean±SD)表示,SPSS13.0统计软件处理数据,多个样本的均数比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 移植后大鼠心功能的比较
2.2 天狼星红染色结果 图1中红色为胶原纤维。心肌胶原容积分数(CVF)分析:与模型组相比,MSCs-hHGF组和MSCs组CVF皆显著降低(P<0.01;P<0.05)并且MSC-hHGF组CVF和MSCs组也存在明显差异(P<0.05)。各组CVF如下:对照组1.60±1.09%;模型组:7.00±0.41%;MSCs-hHGF组:2.05.±0.27%;MSCs组3.44±0.60%
图1
心肌胶原天狼猩红染色结果(n=8,×100)
2.3 心肌中hHGF的免疫组化 图2中金黄色为hHGF在心肌中的表达,MSCs-hHGF组hHGF含量明显高于其他各组(P<0.01),其他三组间无明显差异(P>0.05)。各组吸光度值(OD)如下:对照组OD=175,DCM模型组OD=162;MSCs组OD=183;MSCs-hHGF组OD=4254。
2.4 心肌细胞凋亡(TUNEL法)结果 图3中蓝色为正常心肌胞核,黄色为DAB染色的凋亡胞核。同模型组相比,MSCs-hHGF组和MSCs组心肌AI明显减小(P<0.01;P<0.05),而MSCs-hHGF组和MSCs组之间无明显差异(P>0.05)。各组AI如下:对照组:对照组:9.56±2.06%;模型组:23.90±3.19%;MSCs组:17.24±2.46%;MSCs-hHGF组:15.52±2.78%;凋亡率指数AI=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)。
图2
心肌hHGF的表达(n=8,×100)
图3
心肌TUNEL法凋亡结果
3 讨论
将MSCs直接注射到DCM心力衰竭大鼠的心肌内,发现可以提高心功能[1],但是类似此种MSCs移植治疗效果仍然有限[5] ......
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