巴洛沙星片微生物限度检查方法验证试验研究
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【摘要】 目的 建立巴洛沙星片微生物限度检查法。方法 制备1:10、1:100的供试液，采用离心沉淀与薄膜过滤的方法，来测定试验菌的回收率。结果 供试品稀释100倍后，采用离心沉淀与薄膜过滤法，回收率即可达70%以上。结论 可采用离心沉淀与薄膜过滤法消除巴洛沙星的抑菌活性，建立其微生物限度检查法。
【关键词】巴洛沙星；验证试验；离心沉淀；薄膜过滤
A method for validation of microbial limit tests of balofloxacin tablets
LENGJia-wei.The Drug Control INstitue of Shandong, Shandong 250101,China
【Abstract】 Objective To set up a method for dermiming microbial limits inbalofloxacin tablets.Methods 1:10,1:100 sample test solution were prepared, and the centrifugation,membrane filtration method were applied.The recovery was detected.Results When the sample dilution 100 times, the recovery was over 70% with the method ofcentrifugation and membrane filtration.Conclusion After method of centrifugation collection and membrane filtration, the amount of bacteria and controled bacteria can be determined in balofloxacin tablets.
【Key words】
Balofloxacin; Validation; Centrifuqation; Membrance filtration
巴洛沙星是第三代喹诺酮类抗菌药，具有广谱的抗菌活性[2]。根据《中国药典》2005年版二部规定所有非规定灭菌制剂及其原料、辅料，在建立其微生物限度检查法之前，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该制剂的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌检查方法[1]。据此作者对巴洛沙星片的微生物限度检查法进行了验证试验的研究，建立了巴洛沙星片的微生物限度检查方法。现报告如下。
1 仪器与材料
1.1 仪器 BSC-1500ⅡA2-X生物洁净安全柜；MJ-250I生化培养箱；GHP-9270隔水式恒温培养箱；SartoriusCP225D电子天平；HTY-2000B集菌仪(杭州泰林医疗器械厂生产)；NS01-75D2薄膜过滤器(北京牛牛基因技术有限公司)。
1.2 培养基 营养琼脂培养基(批号：081215)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号：080520)、营养肉汤(批号：070313)、改良马丁培养基(批号：0810092)、胆盐乳糖增菌液(批号：080117)稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：080921)均购于北京三药科技开发公司。
1.3 药物 巴洛沙星片(山东罗欣药业090230)规格：0.1g/片。
1.4 菌株 大肠埃希菌(Eschrichia coli)[CMCC(B)44 102]；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26 003]；白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]；黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]均购于中国生物制品检定所医学菌种保藏中心，以上菌种均为第3代菌种。
2 验证方法与结果
2.1 菌液制备[1] 按《中国药典》2005年版二部附录“微生物限度检查法”项下方法制成50~100 CFU/ml的菌悬液。
2.2 供试液制备 取供试品10 g，研磨加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1:10的供试液，再稀释成1:100的供试液。取1:100的供试液以500 r/min离心3 min取上清液，经过滤后备用。
2.3 菌数计数方法的验证
2.3.1 细菌数验证方法的预试验
2.3.1.1 试验组 取上述制备好的1:100供试液1 ml，按薄膜过滤法处理，用冲洗液分别冲洗滤膜5次，100 ml/次。在最后一次冲洗液中分别加入试验菌50~100 CFU/ml，取出滤膜分别贴于营养琼脂平板上。将平板置30℃~35℃培养48 h，计数。
2.3.1.2 菌液组 测定加入的每一种试验菌数。
2.3.1.3 供试品对照组 按试验组的方法和条件测定供试品的本底数。
2.3.1.4 稀释剂对照组 按试验组的方法，加入50~100 CFU/ml菌液，测定其菌数。
2.3.2 细菌数验证方法的正式试验 由预试验结果表明，巴洛沙星对细菌具有较强的抑制作用，鉴于此作者把试验方法调整为取1:100的供试液1 ml，冲洗量增至1000 ml，重新进行验证试验。
2.3.3 霉菌和酵母菌数验证方法
2.3.3.1 试验组 取1 ml的1:10供试液和50~100 CFU/ml的菌液注入1个平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株菌制备2个平皿。
2.3.3.2 菌液组 测定加入的每一种试验菌数。
2.3.3.3 供试品对照组 按试验组的方法测定供试品的本底数。
2.4 结果 回收率的计算公式：[(试验组菌落计数(稀释剂对照组菌落计数)-供试品对照组菌落计数)]÷ 菌液组菌落计数×100%，最初采用1:10稀释度进行了摸索性试验，结果三种试验菌均受到抑制，尤其对枯草芽孢杆菌回收率为0；故作者在预试验中直接采用1:100稀释度,从表1结果显示，三种试验菌的回收率也未达到70%以上，说明巴洛沙星的抑菌作用2.5 控制菌检查方法的验证 ......
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